4D-组学新时代！引领高通量蛋白质组学

离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。

4D-Proteomics

™是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

图1. 新一代4D-蛋白质组学示意图

4D组学新时代！引领高通量蛋白质组学

蛋白质组学不仅仅是寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一，而且在对癌症、老年痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面也有十分诱人的前景。高通量蛋白组学则成为了生物医学基础研究和应用开发的重要前沿和突破口，而如何实现对大队列样本稳定可靠地分析也逐渐成为了科研热点和难点。总的来说，实现高通量蛋白组学面临如下挑战：

蛋白质组学样本自身的复杂性（蛋白丰度的动态范围>106, 图2）使得低丰度蛋白鉴定异常困难；

目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，使得短梯度下难以实现蛋白深度覆盖；

大队列样本分析对高通量方法和仪器稳定性提出了很高的要求。

图2. 完整蛋白质组的复杂特性

为了应对这些挑战，开发更快扫描速度和更高灵敏的质谱仪是提升蛋白覆盖深度最有效的办法，保证蛋白覆盖深度的前提下缩短色谱梯度是提高临床大队列样本分析通量的捷径，这些新的需求对质谱技术提出了更高的要求。德国Max Plank生化研究所主任Matthias Mann教授作为蛋白质组学领域先驱者之一，他与布鲁克共同研发了“4D-Omics”质谱平台timsTOF Pro，让蛋白组学技术产生了革命性的变化，超过120Hz的MS/MS扫描速度，出色的稳定性和灵敏度使其正成为临床高通量蛋白组学研究的理想平台。为了尽可能的发挥其优势，布鲁克应用专家以及timsTOF Pro的用户也做了大量的工作，并开发了一些成熟的方案。

方案一：timsTOF Pro + nanoElute LC 高通量蛋白组学先驱

布鲁克nanoElute LC为timsTOF Pro质谱标配的纳升流液相，布鲁克应用专家在此平台上，开发了短梯度色谱方法（图3A），此方法28.8min一个循环，连续30针HeLa进样，单针进样200ng的HeLa平均可以鉴定4180种蛋白质（图3B），26000条多肽（图3C），30针重复的相关系数R>0.97（图3D），这些结果表明，此方法与timsTOF Pro的高扫描速度和灵敏度结合，能同时兼顾分析通量和蛋白覆盖深度。我们将此方法用于多组份样本分析，小于12小时即可完成24个组份分析（图3E），HeLa样本24个组份可以鉴定大于9000种蛋白质，小鼠小脑样本24个组份可以鉴定大于10000种蛋白质。

图3. 基于nanoElute短梯度高通量方案

方案二：timsTOF Pro + Evosep One LC 临床蛋白组学黄金搭档

同时，布鲁克还与Evosep公司合作，联合推出用于临床蛋白质组学研究的整体解决方案，timsTOF Pro出色的扫描速度和灵敏度与Evosep One LC强大的分离能力和稳定性完美适配。借助此方案，5min的色谱梯度，单针200ng进样可以鉴定到1400种蛋白质（图4D），7000条肽段（图4E）。

图4. 基于EvosepOne LC短梯度高通量方案

timsTOF Pro与Evosep One高通量蛋白组学平台，得到了英国牛津大学纳菲尔德医学系蛋白质组学项目负责人Roman Ficher博士的青睐，他正在采用这套系统进行血液蛋白组研究，用于快速发现疾病标志物，他们最近的结果显示出了这套系统用于临床大队列研究极佳的性能。他们在研究中将收集的192例血浆样本去除12个高丰度蛋白后，酶切肽段在timsTOF Pro与Evosep液相平台上使用11.5分钟梯度（对应每天近100例样品的分析）分析，样本测试中插入20针QC样本进行质控，总计212个样本仅需51小时即可全部完成测试（图5A），这项工作采用传统的质谱方案可能需要接近10天的时间。实验结果显示，采用4D Match Between Runs进行计算，192个样本中，可以对500个蛋白进行定量分析，并且CV值小于10%， 而QC样本的CV值小于5%（图5B）。

图5.  Roman Fischer博士血液蛋白组研究案例

不管是采用布鲁克的nanoElute LC方案还是Evosep公司的Evosep One LC方案，都能极大提高蛋白组学的分析通量。在提高分析通量的同时，研究人员最为关注的就是仪器的稳定性。仪器抗污染能力和重复性则是其是否适用于临床大队列研究的另一重要评判标准，频繁的仪器清洗不仅会影响项目的进展，消耗机时，而且仪器清洗前后定量分析的一致性也存在疑问。

通过连续运行96个HeLa样本(图6)，仪器体现出非常好的重现性和稳定性，第1针进样和第96针样，Pearson Correlation为0.97，同时选取7个不同丰度蛋白质来评价仪器的稳定性，可以看到连续96针进样下7个蛋白的强度没有明显变化。

图6.  timsTOF Pro稳定性和重复性评估

综上所述，timsTOF Pro带来的采集速度与灵敏度的同时提升，使得其在短梯度下也能实现蛋白深度覆盖，结合其在大队列样本分析中展现出的卓越稳定性，相信基于4D质谱平台开发的高通量和高灵敏度临床蛋白组学方法，必将在生物医学基础研究和临床诊断中有着广阔的应用前景。

参考文献：

Marco Y. Hein, et al., Proteomic Analysis of Cellular Systems, Chapter 1, Handbook of SystemsBiology, 2013

Thomas Kosinski, et al., Plasma proteomics goes high throughput-timsTOF Pro with PASEF and 4D feature alignment to quantify 500 plasma proteins in 11.5min. App Note 1867805

Thomas Kosinski, et al., Maximized throughput and analytical depth for shotgun proteomics using PASEF on a TIMS equipped QTOF. ASMS 2018, TP 685

Thomas Kosinski, et al., Short nanoLC gradients optimize throughput on a timss equipped QTOF with PASEF, ASMS 2019, TP 514.