Nature Materials: 细胞-基质复合模型(CoCS)修正软基质形变效应获取真实细胞弹性模量

2020-07-12 23:19:13 布鲁克（北京）科技有限公司-纳米表面仪器

布鲁克文章推荐第40期

Bruker Journal Club

布鲁克纳米表面仪器部王鑫博士

细胞的表观模量已经成为研究细胞力学、表征细胞生理特点的重要物理参数。在细胞迁移、黏附于生长的过程中表观模量也会发生变化。细胞周围的生长环境的软硬会显著的调控细胞的力学行为，因此在不同软硬的培养基质上获取细胞真实的弹性模量就显得尤为重要。传统的基于AFM力曲线测通过Hertz模型获取细胞弹性模量。如果细胞培养基质很软，则在力曲线实验中基质同样会产生很大形变，细胞的弹性模量会因为 “软基质效应“被显著低估。英国剑桥大学的Kristian Franze教授及其团队在传统Hertz模型基础上发展了细胞-基质复合模型(composite cell–substrate model，CoCS模型)，并通过CoCS模型很好的修正了”软基质效应“获取了细胞真实的弹性模量。相关工作(Cortical cell stiffness is independent of substrate mechanics)于2020年5月25日发表在《Nature Materials》杂志上(DOI: 10.1038/s41563-020-0684-x)。

AFM力曲线测试中，通过Hertz模型拟合力曲线中加载力与细胞形变的关系获取弹性模量，

其中，r为探针半径，ν_cell为细胞泊松比，近似可取ν_cell ≈ 0.5，E_cell为细胞的表观弹性模量。细胞的形变可以通过压电陶瓷位移ΔZ与探针偏转型变量d获得，δ = ΔZ-d。在玻璃或者塑料材质的培养皿上培养细胞能很好的符合这一模型假设，从而获取可靠的细胞表观弹性模量。然而，当细胞在很软的水凝胶基底上进行培养时，即使很小的加载力也会使细胞对基底产生显著形变，从而使总的形变量δ包含细胞的形变量δ_cell与基底的形变量δ_substrate两部分，即δ_cell+ δ_substrate = ΔZ-d。常规的Hertz模型分析因此无法很好的应用于软基质培养的细胞。

AFM将细胞压入柔软基质的形变量测量

硬度较小的小胶质细胞培养在不同硬度的聚丙烯酰胺(PAA)水凝胶上(E_substrate = 50 Pa ~ 20 kPa)。 AFM和共聚焦显微镜联合使用，通过荧光图像分析探针以不同压力将细胞压入基质产生的基质形变量δ_substrate变化。共聚焦成像显示，在较硬的基质上(E_substrate = 2 kPa)，探针加载到细胞的力对基质的形变并不显著(图 1a)，与之相对的，在较软的基质上(E_substrate = 100 Pa)，施加到细胞上的力对基质产生了微米量级的形变(图1b)。进一步的分析表明，施加到细胞上的力与基质的形变量δ_substrate成正比(图1c、d)。基质的刚度可以通过斜率c = δ_substrate/F来比较，对于硬基质与软基质，斜率分辨率0.9 μm/nN和0.1 μm/nN。

基质形变与应力分布的模型建立与数值模拟

为了精细的测量细胞对基质相互作用应力与形变的分布，使用 ERISM成像测量基质的形变量与应力的空间分布。ERISM成像表明，悬臂对细胞施力的正下方中心，有着最大形变量与最大应力，形变与应力随着远离中心近似线性衰减，在10 μm以外逐渐衰减到零。假定细胞与基质接触为轴对称的，中心最大应力为σ₀，经过距离R应力衰减为零，这样的接触可以用Boussinesq表示描述，

这里取ν_substrate ≈ 0.5，对于很软的PAA水凝胶基质可以很好的描述。球形探针与细胞的接触仍可采用Hertz模型，即，

前面提到了力曲线测得的形变量包含细胞与基质的形变，即，

结合式③与式④可以得到细胞-基质复合模型，即CoCS模型，

根据上面的分析，对于球形探针，这里取,

其中c与基质的弹性模量成反比，可以用来描述基质的形变特性。数值模拟表明，在较硬的基质上，Hertz模型与CoCS模型都可以很好的拟合应力-形变曲线。而在柔软的基质上，Hertz模型无法精确拟合，CoCS模型可以很好的修正基质形变带来的影响从而获取样品本征的弹性模量(图2)。

PAA凝胶珠验证CoCS模型的可靠性

通过合成尺寸、弹性与细胞相似的PAA凝胶珠(1 ~ 2 kPa)，将PAA凝胶珠放置在硬基质(E_substrate = 10 kPa)与软基质(E_substrate = 1 kPa)上测量PAA凝胶珠的弹性模量。结果表明，Hertz模型仅能在硬基质上良好拟合获取弹性模量，在软基质上，Hertz模型显著低估了凝胶珠的弹性模量。而CoCS模型可以在硬基质与软基质上很好的获取凝胶珠的弹性模量，且不同软硬基质上获取的弹性模量数据无显著差异(图3f)。可见CoCS模型很好的排除了基质形变带来的影响。此外，使用CoCS模型拟合得到的参数c可以很好的反应基质的形变难易特性(图 3e)。

CoCS模型拟合基质培养细胞的弹性模量

小胶质细胞培养在软硬各异的PAA凝胶基质上，使用Hertz模型与CoCS模型获取细胞的弹性模量进行比较。结果与PAA凝胶珠的测试结果十分一致，即Hertz模型仅在硬基质上能较好的拟合，且在软基质上大大低估细胞的弹性模量，而CoCS模型可在硬基质与软基质上均获得可靠的结果(图 4a~f)。细胞内的肌动蛋白与细胞的弹性模量有着密切关系，同时可以通过感知培养基质的软硬来调控细胞模量。Blebbistatin肌动蛋白抑制剂处理后，细胞失去对基质软硬感知能力，同时细胞本身模量降低。降低的细胞模量使基质模量与细胞模量之比更大，Hertz模型的拟合会更加准确。对Blebbistatin未处理的细胞本身模量较高，基质模量与细胞模量之比较小，Hertz模型拟合会低估细胞的模量。这时，Blebbistatin处理细胞与否对模量影响的显著性就会下降。使用CoCS模型可以很好的排除基质软硬对细胞模量测量的影响，可以更好的还原细胞本征的力学特性 (图 4h)。

为了进一步验证该模型的准确性，该工作还使用Hertz模型测得的细胞弹性模量进行回归分析。可以看出，随着基质模型与细胞模量比值增大，细胞模量越接近硬基质上测定的细胞模量(图 5)。回归分析的数据与数值模拟(图 2e)的有着一致的趋势，再次说明了Hertz模型对细胞模量低估的机理与CoCS模型的可靠性。

该工作使用了Bruker JPK NanoWizard®与 CellHesion® 200结合荧光显微镜与共聚焦显微镜完成。CellHesion®可以提供高精度的超大Z方向量程，用于球形胶体探针与细胞模量、粘附力等生物力学的测试。Bruker全新的NanoWizard® 4 XP BioAFM可以通过结合CellHesion® 200扫描器、CellHesion®模块或HybridStage™实现高精度超大Z方向量程。同时NanoWizard® 4 XP BioAFM可以结合多种先进光学显微镜(例如共聚焦、转盘式共聚焦显微镜、全反射显微镜、超分辨技术与单分子荧光技术)。