色谱柱越长，纯化效果越好吗？

这个问题很有意思，值得探讨，而且我们时不时的都会被问及，目前来说，在整个纯化色谱领域存在着两个不同的认知：一部分人认为又长又细的色谱柱拥有更好的分离效果，另一些则喜欢较短较粗的色谱柱来进行纯化分离。

那么，哪个是对的呢？我们将会根据我们自己的一些数据来回答这个问题。

对于有机和医药化学家来说，快速制备色谱是合成工作流程中不可或缺的一部分——毕竟，合成后需要将产品分离出来。

多年来，在我们与化学家们的交谈中了解到，他们的纯化目标主要有三个：收率，纯度以及速度，并且按照其重要性排序如下：

1.  收率  (需要足够的底物进行下一步的合成)

2.  纯度  (正常的中间体产物纯度在90%或者85%以上即可)

3.  速度  (肯定是越快越好，但不能以牺牲产量和纯度为代价)

对于大多数化学家来说，带有预装色谱柱的自动快速制备色谱系统可大大提高纯化效率；这种快速制备色谱系统通常具有预设的方法——选择色谱柱类型、溶剂、洗脱以及检测方法之后，按下运行按钮即可开始纯化操作。根据色谱柱大小和流速的不同，大部分样品的纯化可以在20分钟内完成，因此通过此系统，速度问题可以得到完美解决。然而，当涉及到目标化合物的收率和纯度时，柱效（塔板数）和选择性（目标产物和杂质的性质差异）就变成了我们需要认真考察的重要参数。(也称为板数)。

柱效越高目标化合物的纯度越高，选择性越高目标化合物的产量也越高。但这些参数对快速制备色谱柱的设计有何影响呢？例如，比如色谱柱的长度以及直径，在我们与化学家们的交流中发现，许多化学家都认为，色谱柱越长越细分离效果越好，那么事实是否如此呢？

色谱柱越长确实分离效果越好，这一点毋庸置疑，然而我们在分离时还希望所消耗的溶剂越少越好，同时色谱峰越窄越好。快速制备色谱系统恰能满足这一要求，更粗的色谱柱具有更大的负载能力，同时可以使色谱峰变窄。事实上，色谱柱的直径每增加一倍，负载能力就增加4倍——这是设计制备色谱柱(快速色谱和高压制备液相)时一个重要的参数。

在制备液相色谱的实际体验中，纯度和产量是两个相互影响的概念，载样量越高，目标化合物的产量越高，但此刻纯度会收到影响。而负载量越低，纯度会相应提高，但是产量则被降低了。实际应用中，我们需要在纯化过程中，同时兼顾到纯度和产量。

根据我们的经验，如果快速制备色谱柱含有相同的吸附剂，那么不管是较长较细的色谱柱，还是短而粗的色谱柱，都没有太大的影响。实际上，无论是湿法上样还是干法上样，当上完样品后，样品都会扩散到色谱柱的柱壁上，以带状洗脱。对于较长较细的色谱柱，洗脱带较尖，根据负载量的不同，可能会降低色谱柱的分离效果。对于短而粗的色谱柱，虽然每个色谱柱的分离效果不同，但是样品会分布在更大的表面积上，因此洗脱带较薄，它们沿着色谱柱向下迁移。除非色谱柱中的吸附剂存在严重差异，否则分离效果是相似的。

为了验证长径比这一参数对快速制备色谱柱的影响，我们比较了25g Biotage SNAP Ultra色谱柱(约25µm)和Isco Redisep Gold 24g色谱柱(约30µm)，前者的长径比约为2.40(短而粗)，后者的长径比约为4.74(长而细)。我们进行了三次实验，第一次使用SNAP Ultra 25克色谱柱，流速为75mL/min(这是系统默认流速)。第二次使用Isco RediSep®Gold 24克色谱柱，也是以75mL/min的流速。第三次也使用了IscoRediSep®Gold 24克色谱柱，但使用了Isco系统推荐的35mL/min的流速。我们选择使用两种不同流速的Isco色谱柱的原因是流速对分离效果也有很大影响。实验结果，见表1。

表1：

图1是Biotage SNAP Ultra 25克色谱柱和Isco RediSep®Gold 24克色谱柱在相同负载量和流速(75mL/min)下进行的分离实验结果。两个色谱柱都进行了分离，这次实验表明，Isco色谱柱洗脱的化合物峰不对称，保留率较低，与Biotage色谱柱相比，馏分体积增加了。而最后一个峰的分裂是由于洗脱剂的极性(IPA)造成的。保留率存在差异，部分原因可能是Isco色谱柱和Biotage色谱柱使用了不同的二氧化硅，尽管两者的粒径都在25-30µm左右。

图1.SNAP Ultra 25克(上图)和Isco RediSep®Gold 24克（下图）色谱柱以75mL/min的流速运行，Isco色谱柱洗脱速度更快，但峰型较宽且形状不规则。SNAP Ultra色谱柱的长径比约为2.40，而Isco Gold的长径比几乎大了2倍，约为4.74。洗脱剂通过Isco色谱柱的流速增加了馏分体积，并部分造成了前峰。

当以较慢的流速35mL/min运行时，IscoRediSep®Glod色谱柱洗脱出的峰稍微更尖一些，但仍然在前方；馏分体积也略有减少，如图2所示。然而，总体分离效果没有改变。

图2.在相似的流速下，短而粗的色谱柱(上图)与长而细的色谱柱相比，显示出更好的分离效果。

然而，通过色谱图并不能说明全部情况。除明显差异之外，为了发现其他差异，我们通过以下方式分析数据：

1.     比较复合分数体积与保留体积的比率。比率越小，柱效越高，分离效果越好。

2.     分辨率是由相邻峰保留体积的差除以相邻峰的分数体积之和来计算，公式是：

Rs=ΔL/(0.5*(w1+w2))¹

其中：ΔL=相邻峰之间的距离，w=每个相邻峰的分数体积

表2总结了实验结果。

从以上数据中我们可以看到，与较长较细的Isco RediSep®Glod色谱柱相比，短而粗的色谱柱Biotage®SNAP Ultra提供了更高的分辨率，特别是峰1和2，只需较少的洗脱剂洗脱化合物。

分离度和保留率的差异是由Isco和Biotage使用的硅胶填料的不同引起的。Isco和Biotage硅胶虽然具有相似的粒径(约25-30µm)，但它们的表面化学成分和表面积并不相同。

然而，在一些应用中，长径比的不同会影响到色谱带的宽度。对于此样品，较短较粗的柱子似乎提供了更好的纯化结果。

对于长而细或短而粗的色谱柱纯化，您有什么建议和经验值得分享吗？欢迎和我们沟通交流。