重组腺相关病毒的IEC-HPLC分析法

2020-05-15 20:43:03 东曹（上海）生物科技有限公司

腺相关病毒也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。

重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

目前用于定量的标准生物分析方法需要3天的感染期和1天的分析时间，这成为快速工艺优化的主要障碍。本篇应用采用了强阳离子交换色谱法，建立了一种快速定量分析方法^[1]，分析时间可缩短到20 min以内。

样品制备

重组腺相关病毒2型 (rAAV-2) 参考方法^[2]制备。

分析条件

色谱柱：TSKgel SP-NPR（4.6 mm I.D.×3.5 cm, 2.5 μm）

流动相A：50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 100 mM NaCl（pH 7.5）

流动相B：50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 500 mM NaCl（pH 7.5）

流速：1.0 mL/min

柱温：室温

检测器：UV@280 nm

样品：重组腺相关病毒2型（rAAV-2）

进样量：10-100 μL（1.0×10¹¹DRP）

分析结果

图1. 纯化后rAAV-2载体分离色谱图

图2. rAAV-2载体校正曲线

结果与讨论

采用无孔强阳离子交换色谱柱TSKgel SP-NPR对重组腺相关病毒2型载体进行定量分析，实验结果表明，该方法可以在20分钟内完成一次分析。定量线性范围较宽 (1.0×10¹⁰-5.0×10¹¹DRP, R²值0.997)，可适用于稀释和浓缩样品的分析。收集流出峰紫外光谱与进样样品紫外光谱一致，感染率无明显变化，说明病毒载体分析后仍保留活性。该方法可广泛用于过程开发、基因治疗用重组腺相关病毒的纯化与分析。

TSKgel SP-NPR色谱柱采用了无孔的亲水性聚合物填料，表面键合有强阳离子交换基团，由于其粒径较小，可实现快速分离。该色谱柱尤其适合分析腺相关病毒，并且具有极高的蛋白回收率。

参考文献：

1. D. Debelak, J. Fisher, S. Iuliano, D. Sesholtz, D. L. Sloane, E. M. Atkinson, J. Chromatogr. B, 740 (2000) 195-202.

2. K. R. Clark, F. Voulgaropoulou, D.M. Fraley, P.R. Johnson, Human Gene Ther. 6 (1995) 1329–1341.