APT----氨基酸组成分析

——即蛋白质药物的氨基酸组成分析技术服务

蛋白质药物的氨基酸组成分析是应用高效液相色谱法对经过水解的蛋白质所得氨基酸进行高效、灵敏、快速的定量分析。蛋白质在6 mol HCL中真空状态下经过110℃/24h水解完全形成游离氨基酸，再通过异硫氰酸苯酯（PITC）对所得氨基酸衍生化，用高效液相色谱对所得的衍生产物进行梯度洗脱，使得不同氨基酸衍生物分离开来，通过外标法对每个氨基酸衍生物的含量进行测定，进而得知蛋白质样品中氨基酸的含量信息。

“氨基酸组成分析是蛋白质类药物临床前理化性质分析的必做项目之一”

技术指标

● 样品要求：

供试品为多肽蛋白固体样品，总量应不少于4mg，干燥未潮解；

供试品为多肽蛋白液体样品，浓度应不低于1mg/ml，多肽蛋白总量应不少于4mg，且透明澄清、无混浊、无沉淀。

● 设备特性和色谱参数：

HPLC仪器：高效液相色谱仪（SHIMADZU，HPLC LC-20A）；

色谱柱：氨基酸分析柱（Dikma，Diamonsil AAA（5u 250mm×4.6mm））；

检测器：紫外检测器；检测波长：254nm；流速：1ml/min；

相关液相梯度如下：0-39分钟，B液线性梯度从5%-48%；39-40分钟，B液线性梯度从48%-100%；40-45分钟，B液维持在100%。

异硫氰酸苯酯（PITC）衍生法原理示意图

氨基酸标准品进行PTIC分析的HPLC图谱

案例分析

● 蛋白质类供试品的氨基酸组成分析

流速：1ml/min；检测波长254nm；柱温：30℃。

A液为50mM乙酸钠水溶液（pH 6.5）；B液为 甲醇:乙腈:水=2:6:2混合溶液。

洗脱梯度：

时间（min）

流动相A（%）

流动相B（%）

0955395248400

100

450

100

4695560955

结果：

蛋白质类供试品进行PTIC法测定氨基酸组成的HPLC图谱

Q&A

大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，标准折射探测仪对氨基酸检测也无足够的灵敏度。为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生和柱后衍生两种。柱前衍生法常用的有：邻苯二甲醛（OPA）法、丹磺酰氯（DANSYL-Cl）法、磺酰氯二甲胺偶氮（DABSYL-Cl）法、氯甲酸芴甲酯（FMOC- Cl）法、异硫氰酸苯酯（PITC）法等；柱后衍生法常用的有：茚三酮法、邻苯二甲醛（OPA）法、荧光胺法等。其中柱前衍生法中异硫氰酸苯酯（PITC）法以其衍生方便快速，衍生物单一稳定，分析时间短，结果准确，试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除，紫外检测（254nm）灵敏度高、可达1pmol，一、二级氨基酸均可检测等优点，成为蛋白质组成分析的重要手段。

现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测试蛋白质溶液在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所以将蛋白质水解成游离的氨基酸，对氨基酸进行定量从而来推算蛋白质的含量成为较可靠的方法。按照中国药典对蛋白质药测试的规定，氨基酸组成分析的相对定量已经能够满足检测要求，对蛋白质类药物进行相应的质控和结构的分析，以及样品是否为蛋白质的鉴别。