APT —— Label-free分析服务Q&A（第一版）

1.如何解读报告结果中的附件？

报告结果中除报告主体外共有三个附件，分别为“附件1 蛋白质鉴定表”、“附件2 肽段鉴定表”、“附件3 蛋白质显著性分析表”。基于软件MaxQuant分析得到的各表格相关说明如下：

• 附件1 蛋白质鉴定表

ProteinIDs：该蛋白质组的所有蛋白质的登录号和名称；

Fastaheaders：该蛋白质组中得分最高的蛋白质登录号和名称，即通常认为的鉴定到的蛋白质信息；

Proteins：该蛋白质组中所包含的蛋白质数量；

Peptides：用于蛋白质定性分析的唯一肽段数；

Uniquepeptides：用于蛋白质定量分析的唯一肽段数；

Sequencecoverage[%]：肽段覆盖率；

Mol. Weight[kDa]：蛋白质的理论分子量；

iBAQintensity：iBAQ算法得到的归一化后的蛋白质信号强度。

• 附件2 肽段鉴定表

Sequence：肽段序列；

Mass：肽段分子量；

Charges：肽段电荷数；

Proteins：肽段所属蛋白质组的所有蛋白质登录号和名称；

Leadingrazor protein：“Proteins”中排名第一位的蛋白质登录号和名称，同“附件1 蛋白质鉴定表”中的“Fasta headers”信息列；

Score：MaxQuant的肽段得分。

• 附件3 蛋白质显著性分析表

ProteinIDs：该蛋白质组的所有蛋白质登录号和名称；

Fastaheaders：该蛋白质组中得分最高的蛋白质登录号和名称；

Proteins：该蛋白质组中所包含的所有蛋白质数量；

Peptides：用于蛋白质定性分析的唯一肽段数；

Uniquepeptides：用于蛋白质定量分析的唯一肽段数；

Sequencecoverage[%]：肽段覆盖率；

Mol. Weight[kDa]：蛋白质的理论分子量；

iBAQintensity、iBAQ intensity average、X/Y、p value：两组样品的iBAQ定量强度值、组内重复数据的平均值、两组比较数据平均值的比值、T-test或者ANOVA分析的P值。

本表由“附件1 蛋白质鉴定表”进行数据分析后生成而来，共包含两个子表，分别为定量数据差异分析表与有无差异分析表。“定量数据差异分析表”是在需要比较的两组样本数据中，对符合同组三次重复数据出现两次以上不为零的要求的数据进行比值计算和统计学分析的表格；“有无差异分析表”是对其中一组三次重复数据出现两次以上不为零，另外一组数据所有数据均为零的蛋白质进行分析的表格。因为本附件在进行数据分析时删除了不符合以上两个子表数据统计的蛋白质，所以“附件3 蛋白质显著性分析表”的总蛋白质数量一般小于“附件1 蛋白质鉴定表”中的蛋白质数量。

2. 三次重复质谱实验数据中出现定量值为零的情况，应该如何分析？

质谱分析的特点是：若同一个样品进行多次重复质谱分析，每次质谱鉴定的结果都不会完全相同（Overlap的数据约70%）。只要有一次质谱结果鉴定到某蛋白质，就说明样品中存在该蛋白质。但是为了后续统计分析的需要，一般标准是选取三次质谱重复实验中至少在两次质谱中鉴定到的（即有定量值的数据，且定量值不为零），取平均值；如果只在一次实验中有值，则不采用该数据进行定量分析。当一个样本组中某蛋白质在三次定量结果中均无值（或者显示为“0”），而该蛋白质在另外一个实验组中至少有两次以上定量值不为“0”时，可认为此差异为“有无”表达差异。但是对于质谱结果中“有无”差异的结论一定要慎下，需要其他实验方法的进一步验证。

3. 为什么定量数据中有一部分数据为“0”？什么情况下才会出现有定性但无定量结果的情况？

针对label-free项目，本公司采用MaxQuant软件的iBAQ或LFQ算法进行定量分析，这两种算法的原理都是以MS1为基础，计算每个肽段信号在LCMS色谱上的积分。iBAQ的算法相对较新，应用更广泛，所以一般情况下我们提供iBAQ算法的定量结果。（参考文献：Wilhelm, M., J. Schlegl,et al. (2014). "Mass-spectrometry-based draft of the human proteome."Nature 509(7502): 582-587.）

原因一：肽段属性分为两种，分别为可以用于蛋白质定性的和用于蛋白质定量的唯一肽段，定性肽段数量≥定量肽段数量。对于鉴定到的蛋白质如果没有可以用于定量的唯一肽段，则该蛋白质无定量值，该情况下所有样品的intensity都显示为0。

原因二：如果用于蛋白质定量的肽段信号值在某些样品中太低，就会导致峰面积积分定量无值的情况，从而在该样品中的intensity显示为0。

4. 蛋白质鉴定的可信度的判断标准是什么？

本公司开展的label-free项目一般采用MaxQuant软件进行蛋白质定性和定量分析，蛋白质定性筛选标准为proteinFDR≤0.01, peptide FDR≤0.01。FDR是通过检索目标数据库（Targetdatabase）和Decoy库（Decoy库由MaxQuant软件自动创建）后，根据得到的匹配图谱数量计算得来。FDR≤0.01为公认的组学数据筛选标准，我们提供的报告中的数据均已经通过FDR≤0.01标准筛选，因此均是可信数据。

5. 筛选差异蛋白质的基本原则是什么？

针对Lable-free实验获得的蛋白质定量信息，差异蛋白质的筛选没有统一的标准，但一般需要同时满足差异倍数和统计学分析双重过滤标准，如fold change> 1.5以及显著性分析p value <0.05。如果通过该标准筛选获得的差异蛋白质数量较多，则可根据实际情况或者需求适当提高筛选标准，如fold change>2甚至>4或者p value <0.01等。如果采用的实验设计为技术重复（质谱重复检测），差异倍数过滤标准建议至少提高到两倍以上。

6. 报告中的蛋白只有蛋白质登录号，没有蛋白名称和基因名称，如何进行分析？

质谱查库使用的是蛋白质数据库，一般为Uniprot，NCBI等公用蛋白质数据库或者客户提供的氨基酸序列的自建库（需要Fasta标准格式）。因此，蛋白质鉴定表中只能呈现蛋白质信息，没有对应的基因信息。MaxQuant查库输出的蛋白质鉴定表中只提供蛋白质登录号而不提供蛋白质名称或基因名称，如果客户需要相关的蛋白质或基因信息，可根据结果中“Fasta headers”条目下提供的蛋白质登录号在对应数据库网站查找所需信息，如采用Uniprot公用数据库的查库结果：“>tr|A0AQL9|A0AQL9_TRISPCaveolin OS=Trichinella spiralis GN=cav-1 PE=2 SV=1;>tr|E5S364|E5S364_TRISPCaveolin OS=Trichinella spiralis GN=Tsp_03271 PE=3 SV=1”，客户可以通过登录网站http://www.uniprot.org/，在“Query”框下输入蛋白质登录号“A0AQL9”进行搜索，从而获得该蛋白质的相关所有信息。

阅读全文：http://www.aptbiotech.com/upload/20141016094800xz.pdf