【修饰专栏第七期】磷酸化组学数据解读必备手册

2020-04-08 15:49:57, APTBIO-YJ 上海中科新生命生物科技有限公司

前几期我们主要注重介绍了磷酸化修饰的应用，不知有没有引起各位老师的研究热情。

往期回顾

• 打开研究新视角 ——蛋白质翻译后修饰（PTM）

• 打开研究新视角 ——磷酸化修饰

• MCP-磷酸化修饰与非靶代谢在大豆盐胁迫中的应用

• Cancer Res：恶性肉瘤磷酸化蛋白组表达谱

• 修饰组——非模式物种研究利器

• SCI杂志告诉我修饰组学类文章应该这样设计

如果有老师计划开展磷酸化修饰组学的分析，一探磷酸化修饰的金矿，可以详细阅读下本期内容。本期，我们将给各位详细展示磷酸化蛋白组分析的数据形式，大家可以了解下做完磷酸化修饰组学后，通常能够拿到什么样的数据和结果。在此基础上，我们还为大家带来了磷酸化修饰组分析的Q & A。

整体结果概况图

以我们提供的报告结果为例，项目结果按照毕业论文格式排版，有图标有详细的文字说明，一目了然，清晰易懂。

预实验：

目的是对样本质量、样本制备效果进行评价和判断，以便为拿到好的正式分析的结果提供保障

正式实验：主要包括方法介绍和结果展示
① 方法学：介绍具体的实验流程、方法和所用材料，可以直接放在论文中
② 数据结果：分为修饰鉴定与定量结果，和后续的统计学与生物信息学分析结果。

修饰鉴定与定量结果展示

不同的数据分析软件，给出的数据形式会有所差异，但是几个主要信息一般都是会有的，包括：修饰蛋白的名称、修饰肽段的序列，肽段上哪个氨基酸被修饰，可信度如何，以及被修饰肽段（位点）的定量值，等。以我们输出的结果为例（点击图片查看大图）

表头的注释，简单解释如下：

*由于篇幅所限，以上只是展示了最重要的修饰肽段（位点）的鉴定和定量的结果，如想详细了解完整的结果和说明，可联系我们，索要材料。

统计学与生物信息学分析结果展示

1. 修饰结果统计

通过分析所有修饰位点的分布情况发现，共鉴定到XXX个磷酸化蛋白，XXX个磷酸化肽段，XXX个磷酸化位点，其中”XXX（百分比）蛋白质上分布多个（2个及以上）修饰位点，其中XXX（Protein ID）蛋白质上含有多达XXX个，修饰位点。在所有鉴定的修饰蛋白质中，每100个氨基酸上修饰位点的平均分布数量为XXX。这个就是我们前期文章架构总结中介绍的“花式统计“了。

S、T、Y位点分别在蛋白中的统计和不同比较组修饰位点个数统计结果。

2. 统计学分析结果

定量比值频数分布图（A）：运用频数分布直方图对定量数据进行Log2 对数转化和分析，大部分肽段比值呈对称分布，符合统计学规律，说明质谱结果正常。

火山图（B）：将所有检测到的差异磷酸化蛋白显著性进行可视化展示，图中横坐标为蛋白在两个样本间差异的倍数变化值对数化处理；纵坐标为蛋白表达量变化差异的统计学t检验p值，p值越小则表达差异越显著。红色点为显著差异的蛋白，黑色点为非显著差异蛋白；左边的点为表达差异下调的蛋白，右边的点为表达差异上调的蛋白，越靠左/右边和上边的点表达差异越显著。

PCA图（C）：是一种非监督性的多元统计分析，从总体上反映组内样品的离散程度和组间样品的差异分布。

聚类heatmap和折线图（D）：对样本的聚类结果可以检验所筛选的目标肽段的合理性，即这些目标肽段表达量的变化可否代表生物学处理对样本造成的显著影响；目标肽段的聚类结果可以帮助我们从肽段集合中区分具有不同表达模式的肽段子集合，具有相近表达模式的肽段可能具有相似的功能或者参与相同的生物学途径，或者在通路中处于临近的调控位置。

3. 初级生信分析结果（我们在前几期文章架构总结中介绍的，文章必备生信三宝）

GO 注释和富集（A和B）：GO是对基因和基因产物进行功能标准化数据库，对基因和蛋白功能进行统一的限定和描述。利用 GO 数据库，可以将基因按照其参与的生物过程（Biological Process, BP）、细胞组分（Cellular Component, CC），分子功能（MolecularFunction, MF）三个方面进行分类注释。因此，GO注释和GO有向无环图有助于了解蛋白所参与的生物学功能。

KEGG注释和富集（C和D）：在生物体中，蛋白质并不独立行使其功能，而是不同蛋白质相互协调完成一系列生化反应以行使其生物学功能。因此，KEGG通路分析有助于更系统、全面地了解细胞的生物学过程、性状或疾病的发生机理、药物作用机制等等。

蛋白互作网络分析（C和D）：对蛋白质之间的相互作用及相互作用形成的网络进行研究，对于揭示蛋白质的功能具有重要意义。通过String、Intact或者IPA软件实现蛋白互作网络分析。

4．高级生信分析（我们在前几期文章架构总结中介绍的，修饰必秀的motif）

Motif基序分析和二级结构预测（A和B）：蛋白质翻译后修饰一般需要通过上游的酶去识别底物特定的氨基酸保守基序（motif）来完成。因此，识别和研究修饰蛋白质的保守motif以及预测对应二级结构，对于蛋白质翻译后修饰和修饰位点的预测，以及细胞信号通路的发现具有重要意义。

基本上可以说，上述结果涵盖了主要的修饰组分析结果内容。如果是拿到我们上述的结果，无论是想发表修饰鉴定谱，还是要求不高的修饰定量比较分析，基本上完全可以直接往文章里放，直接去投文章了。

常见问题 Q & A

1. 磷酸化项目能否对磷酸化蛋白进行定量？

质谱磷酸化定量分析的是发生磷酸化修饰的肽段的量的变化差异，从而揭示磷酸化位点修饰程度的改变。由于经过磷酸化富集后，大部分非磷酸化肽段都已去除，无法对蛋白质进行准确定量，所以只提供磷酸化肽段的定量信息，而不提供蛋白质的定量信息。如需要对蛋白质的表达进行定量，需要另外开展蛋白质的定量分析。

2. 为什么同一个蛋白，不同修饰位点的表达量有差异？

同一蛋白不同的修饰形式可能发生在不同的亚细胞位置，参与不同的通路，具有不同的功能，那么该蛋白不同的修饰形式表达量是有差异的。

3. 磷酸化的鉴定水平是多少？

磷酸化鉴定数量一般与物种、组织部位或者不同处理，样品状态，质谱检测时长，参数设置等都有有较大的关系，一般动物组织与细胞、模式植物常规组织鉴定数量达到4000+，其他物种、样本类型的鉴定数量多少不等。通过分级等手段，常规样本的鉴定数量甚至可以达到20000+。

4. 修饰肽段鉴定表中为什么有些肽段被多次陈列？

同一个肽段可能有多个不同的磷酸化位点，因此可能检测到相同肽段的不同修饰形式，每种修饰形式都代表一种不同的肽段，在有些软件给出的结果中磷酸化肽段表中会被依次列出，被修饰的氨基酸用小写字母表示，如下图所示，展示了同一个肽段的三种不同修饰（磷酸化/氧化）状态。

5. Motif基序分析结果描述和意义？

Motif保守基序是Motif-X 软件(http://motif-x.med.harvard.edu/)完成的，筛选参数设置为所有鉴定到的修饰位点对应的sequence windows中出现次数大于50次，且统计学检验P-value<10-5（The number of motif occurrences was 50,andthe significance threshold was set to P-value<10-5）。

通过分析Motif保守基序对应氨基酸残基的疏水性、酸碱性、序列二级结构等，对基序结果进行分类，从而更好挖掘激酶或者磷酸酶作用的新底物以及开发酶的新功能。通过分析这些基序是否具有物种特异性、条件特异性、激酶特异性，寻找蛋白质翻译后修饰的保守性和特异性及细胞信号网络调控的重要靶点。总之，蛋白质翻译后修饰一般需要通过上游的酶去识别底物特定的motif来完成，因此，识别和研究修饰蛋白质的保守motif对于蛋白质翻译后修饰和修饰位点的预测，以及细胞信号通路的发现具有重要意义。

这里我们只列出了最常见的问题，如需要完整的Q & A，可以向我们咨询和索要资料。

经过以上的介绍，是不是感觉磷酸化组学数据结果清晰易懂，文章数据也容易信手拈来呢？

磷酸化修饰的介绍，到这期为止，我们就暂告一段落了。回顾我们这几期的内容，我们为大家系统综述了磷酸化修饰的基础功能与意义，也介绍了在医学和农林领域的典型研究模式和发文章套路，本期我们展示了磷酸化修饰组的数据结果内容与形式。总结一下，磷酸化修饰作为最重要、分布最为广泛的翻译后修饰，几乎参与所有的生物过程，其研究模式和套路也是目前也已经相对比较成熟。但是，磷酸化修饰的具体生物功能和作用机制，目前仍然只算是揭露了冰山一角。因此，无论是医学研究、植物抗逆，还是非模式物种的特色功能研究，磷酸化修饰组的研究模式都可以为大家打开全新的大门。最后，由于那两句评价磷酸化修饰的名言太经典，请允许我们再次引用：

下期预告

我们的重点转移到另外一个非常重要的翻译后修饰——乙酰化修饰。除了大家熟知的组蛋白的乙酰化修饰，实际上，细胞的细胞核之外，还分布着巨大量的乙酰化修饰。其修饰数量之多，功能之重要，也许并不低于磷酸化修饰。然而，目前对乙酰化修饰的了解和认识却极其有限，可以说潜力巨大。从下期开始，我们来一起揭开乙酰化修饰（非组蛋白）的面纱。