Protein G sepharose 4 FF-小填料，多用途，大促销

2020-03-14 19:28:13, Chen Duoduo Cytiva（思拓凡)

Protein G 是一种来自链球菌的细胞表面蛋白，能与 IgG 上的 Fc 和 Fab 区域特异性的结合。

图 1 Protein G 配基与抗体的结合位点示意图

与 protein A 相比，protein G 可以结合的抗体种属来源更广泛，对某些多克隆的 IgG 和人源的 IgG3 的结合更紧密。

在通常的缓冲体系下，G 蛋白能够同所有的人源和鼠源的 IgG 结合，包括鼠源 IgG₁；也能够结合 A 蛋白所不能结合或者结合很弱的 IgG_2a、IgG_2b。

该填料与各种属来源的抗体亲和力见下表：

表 1 Protein G 和 protein A 亲和填料可纯化的抗体种属及类型汇总

Protein G Sepharose 4 Fast Flow 由 90μm 高度交联的琼脂糖作为基架，提供稳固而高流速的层析基质。Protein G Sepharose 4 Fast Flow 散装填料可用于实验室规模空柱的装填，也可以装在更大的色谱柱中，用于工业规模纯化单克隆和多克隆抗体。

Protein G Sepharose 4 Fast Flow 用于抗体纯化的优点

1. G 蛋白是在实验室水平上纯化抗体的一个很好的选择，因为它能够广泛的结合真核来源的各种抗体。

2. Protein G Sepharose 4 Fast Flow 能够在一个很广泛的 pH 范围内结合抗体，并且在中性 pH 时结合能力最强。

3. GE healthcare 的 protein G 配基是从大肠杆菌中重组表达的，去除了白蛋白结合结构域，避免了白蛋白的非特异性结合，这在提高产品质量方面是一个很好的帮助。

用于实验室规模的纯化时，Protein G Sepharose 4 Fast Flow 散装填料有多种使用形式

1. 填装进 PD-10 空柱中（货号：17043501），以重力的方式使用。重力操作不需要依赖于任何设备，方便快捷。

▪ 首先根据样品量取适量的填料加入重力空柱，让储存液（通常是 20% 的乙醇）靠重力流出；

▪ 随后用平衡 buffer 对柱子进行平衡；

▪ 将样品上到平衡好的柱子上后，继续用平衡 buffer 进行杂质的清洗和去除。

▪ 最后用洗脱 buffer 将目的样品洗脱下来。

该流程如下图所示：

图 2 PD-10 重力纯化柱操作流程

2. 填装进离心管中，通过离心的方式使用。离心的方式同样经平衡-上样-清洗-洗脱四个步骤，前三个步骤 buffer 的置换通过离心弃掉上清来实现，最后洗脱时离心收集上清。

离心的方式经常用于免疫共沉淀实验（Co-IP），该方法利用抗体与抗原的相互作用，从粗提物中分离得到与抗体相互作用的抗原或抗原复合物，然后向上述复合物中加入 protein G 或者 protein A 填料。

抗体可以与填料结合，最终通过洗脱，得到抗体及与抗体相互作用的抗原或抗原复合物。随后经过酶切，将得到的成分进行质谱分析，结合蛋白数据库检索，确定跟抗体相互作用的蛋白。

Co-IP 的具体步骤如下：

图 3 Protein G/A 填料在 Co-IP 应用上的操作流程

3. 装填进 XK，HiScale 和 Tricorn 空柱中，连接 ÄKTA 层析系统进行使用。

使用 protein G 填料的常见问题及解答

1	使用 protein G 填料的常见问题及解答在具体的纯化过程中有什么注意事项？

答：根据填料载量和样品中抗体的含量，取适量的填料，一般按照载量的 20-30% 进行填料用量的计算。protein G 结合各种属来源的抗体时，载量如下：

表 2 Protein G 对不同种属抗体的结合载量参考

上样时保证样品条件和初始平衡 buffer 的条件尽量一致，以便样品与填料的结合（在小体积纯化时，这一点尤其重要）。
一般在实验中可以先将填料与样品孵育，以使抗体可以充分捕获目的蛋白。或者降低上样流速，以使填料和样品充分结合。
洗脱时，一般用低 pH 值（pH2.5-3）的条件进行洗脱，因此建议在样品收集管中按照每毫升洗脱产物 60-200μl 的比例加入 pH 9.0 的 Tris-HCl，以便样品洗脱后可以尽快恢复至中性 pH 条件，有助于保持样品的稳定性。
做免疫共沉淀实验时，在清洗液中加入低浓度的非离子型去垢剂，如：Triton-X-100 或 NP-40 等，可以降低由于疏水作用引起的非特异性吸附。或者适当提高盐浓度，以降低由静电作用引起的非特异性吸附。

2	填料可以重复使用吗？清洗的条件是什么？

答：Protein G Sepharose 4 Fast Flow 填料是可以重复使用的，再生条件如下：

常规再生：用 2-3 倍柱体积的洗脱 buffer 清洗填料后，立即用 2-3 个柱体积的结合缓冲液进行柱子的再平衡。

当柱子压力升高，或结合能力降低时，提示可能需要对柱子进行彻底的在位清洁：

去除沉淀和变性蛋白：用两倍柱体积的 6M 盐酸胍洗，然后用 5 倍柱体积的 binding buffer 清洗。
去除结合紧密的疏水性蛋白、脂蛋白、脂类：用去垢剂如 0.1% 的 Trion X-100 在 37℃ 处理 1 min，或者用 70% 的乙醇处理 12 h，然后立即用 5 倍柱体积的 binding buffer 清洗。