寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例

2020-03-13 12:08:03 东曹（上海）生物科技有限公司

概 述

寡核苷酸是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。


近几年，随着寡核苷酸疗法在治疗各种疾病适应症方面取得了临床上显著的进展，已有多种寡核苷酸类药物，如小干扰RNA (siRNA) 和反义寡核苷酸 (ASO) 药物获得了FDA上市批准。另外还有多种microRNA (miRNA) 和适配体 (Aptamer) 正在研发中。因此，更大量、更高纯度的寡核苷酸产品的需求也随之日益增长。


东曹生命科学提供多种具有高分辨率、选择性的色谱柱和层析填料产品以满足从分析到纯化制备不同规模的应用需求。


寡核苷酸的HPLC分离模式


下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。



治疗性寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。一般而言，通过阴离子交换色谱法即可实现这一分析需求。


寡核苷酸IEC-HPLC分析


下图是使用TSKgel DNA-STAT阳离子交换色谱柱分离具有不同序列的4种寡核苷酸引物 (单链) 。

在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。此款色谱柱采用的是亲水性无孔树脂填料，粒径5μm，表面由开放型多层阴离子交换基团构成。这些特性与创新的化学键合方法相结合，使其载量更高、操作压力更低，非常适合于寡核苷酸的高分辨率分析。


寡核苷酸的纯度检测


在离子交换色谱柱中，可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离，比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。




TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。



寡核苷酸的分析要点


1、根据核酸样品的稳定性和大小来选择合适的洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以采用碱性溶液 (NaOH，pH12) 和高温60℃条件下分离，可提高分辨率。如果是稳定性差的，则推荐使用pH7-8的中性洗脱液，温度40℃条件下分离。


2、在样品吸附强的情况下，可使用比NaCl或NaBr洗脱能力更强的NaClO4进行梯度分离。


3、如果样品是超巨大双链DNA (如质粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。


在下一篇推送中，小编将会为大家介绍尺寸排阻色谱在寡核苷酸HPLC质量控制中的运用，以及SEC色谱柱的应用实例，敬请期待。


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