Microsart® Geneprep可保证截留微生物获得出色的回收率

Microsart® Geneprep适用于从至少100 ml的液体中浓缩并提取微生物DNA的试剂盒-为渴望以可靠、快速和便利的方式实现污染控制的人士提供完美解决方案。该试剂盒包含过滤装置，用于对大容量液体进行样品浓缩和DNA提取。我们新型专利膜溶解技术在市场上独一无二。因此，可以确定每一个被截留到滤膜上的微生物都可以被检测到。

作者

Alexandra Mueller-Scholz 和 Kai Nesemann

使用竞争性产品对Microsart® Geneprep试剂盒对加入嗜肺军团的菌水样进行DNA分离效率验证测试。

引言

军团菌是常见的致病细菌，存在于天然和人造水系统中，可导致严重的肺部疾病。尤其是在温水分配管或冷却塔等人造水系统中，军团菌可能会大量繁殖，导致散发性疾病甚至爆发疾病。冷却塔是一种常用于工业现场或医院等大型公共建筑制冷装置的设备。军团菌生长的有利环境是温度介于20至45°C，含沉淀物、水垢、污泥或生物膜等营养成分的温水，因此在人造水系统中经常发生。

图 1：培养5天后的嗜肺军团菌菌落。

最常用的检测水中军团菌污染的方法有两种：(1)传统的膜过滤方法，后续进行菌落计数和(2)核酸扩增技术(NAT)，通过聚合酶链式反应(PCR)进行基于DNA的检测。后续进行菌落计数的膜过滤方法需要至少五天的培养时间(参见图1)。培养时间是以传统培养为检测手段的瓶颈。此外，单细胞荧光测定法(例如荧光显微镜法)证明，由于受到应激或聚集的细胞影响，平板计数法低估了实际细胞数量几个维度[1][2][3]。NAT不受培养影响，也无需进行长时间的温育和麻烦的菌落计数。那么为何不把等待结果的时间从动辄几天或几周缩短到仅仅数小时呢？然而，从膜上回收污染物以进一步提取DNA可采用不同的策略。一些供应商建议通过清洗来回收被捕获的细菌。相比之下，Microsart® Geneprep可以溶解膜，是唯一能够保证完全回收的试剂盒。

迄今为止，由于NAT测试系统缺乏灵敏度且可插入样品的容量较小，限制了其在微生物检测中的使用。

本研究提出了两种克服这些限制的方案。在灵敏度方面比较了两种用于100mL液体样品过滤和DNA提取的试剂盒。

实验设置和结果

蒸馏水中加入嗜肺军团菌，浓度为每105个细胞/100mL。根据试剂盒供应商P和赛多利斯Microsart® Geneprep试剂盒的使用说明，分别对100mL加标水进行样品过滤和DNA分离[4] [5]。

两种样品制备试剂盒均可提供即时分析DNA。为了进行后续分析以评估两种样品制备方法的DNA提取效率，使用了AquaScreen®军团菌PCR实时荧光定量试剂盒(供应商：Minerva Biolabs GmbH)。已经确定并比较了两种产品的Ct值。表1概述了供应商P和赛多利斯Microsart® Geneprep试剂盒的不同步骤。

表1：供应商P和赛多利斯Microsart® Geneprep试剂盒的样品制备程序

验证测试结果见表2。使用这两种方法，所有加标样品均检测为军团菌阳性。一直将供应商P产品处理的样品的Ct值与Microsart® Geneprep处理样品的Ct值进行比较。使用每种方法的平均值计算得出ΔCt：

ΔCt = (平均值-Ct供应商 P) – (平均值-CtMicrosart®Geneprep)

所有测试至少重复四次（n≥4）。

使用Microsart® Geneprep和供应商P的产品并行开展嗜肺军团菌检测，确定样品的平均ΔCt值约为2.8。

通常，可以认为：ΔCt的值越大，程序的回收率和灵敏度越高。ΔCt为～3.3，与提高约一个对数水平的灵敏度相对应。与供应商P的产品相比，Microsart® Geneprep的回收率增加了7倍(2(2,8)≈7)。

表2：供应商P和赛多利斯Microsart®Geneprep 试剂盒的Ct值

结论

Microsart® Geneprep为基于DNA方法的军团菌检测提供了灵敏的样品制备体系。与来自供应商P的竞争产品相比，使用Microsart® Geneprep样品制备试剂盒，灵敏度可提高七倍。

本次研究表明，使用Microsart® Geneprep样品制备试剂盒时，用AquaScreen®军团菌实时荧光定量PCR试剂盒检测军团菌的灵敏度可提高7倍。

在爆发疾病的情况下迅速而灵敏地测定军团菌对于帮助保护公众健康至关重要。基于这一原因，Microsart® Geneprep样品制备试剂盒是结合使用任何DNA检测方法获得高度灵敏和快速检测结果的最优解决方案。因为所有的检测方法都与之前的样品制备方法一样灵敏。如果由于膜过滤器的回收率低，样品过滤后细菌已经直接丢失，您所选的细菌检测法的灵敏度并不重要，因为早在样品制备过程中已经失去了大部分分析物。相比而言，Microsart® Geneprep甚至不尝试从滤膜中回收所有被截留的微生物，因为这几乎是一项不可能完成的任务；相反，该试剂盒中包含可溶解的滤膜，保证所有微生物都可以在溶解液中回收，供进一步的DNA分离和检测使用。

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参考文献

[1] H. M. Davey, Applied and Environmental Microbiology, 2011年，第77卷，第16期，第5571-5576页

[2] M. A. E. Auty et al, Applied andEnvironmental Microbiology, 2001年，第67卷，第1期，第420-425页

[3] D. Hoefel et al., Journal of Microbiological Methods, 2003年，第55卷，第3期，第585-597页

[4] PALL GeneDisc Technologies, Extraction Protocol GeneDisc DNA Extractor®, 2010年7月版

[5]赛多利斯，Microsart® Geneprep使用说明书，出版编号:SL-6028-e160602, 06/2016

[6] Minerva Biolabs, AquaScreen® Legionella specc.使用说明书， 09/2012

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