案例分享 | 支原体检测法详解：培养法和qPCR法对比

支原体分离培养法，顾名思义，是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。需要注意的是，培养法尽管可以检测绝大多数支原体种类，但个别支原体仍无法检测到。

口腔支原体（ATCC23714）或肺炎支原体（ATCC15531）、75%无菌酒精、支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基、支原体琼脂培养基

个人防护设备（无菌手套，洁净服等）、生物安全柜、CO2 培养箱、厌氧罐、倒置显微镜（放大倍数：10×10）

1. 取0.2ml待检样品接种到2块支原体琼脂培养基平板。

2. 取100cfu的口腔支原体或肺炎支原体接种2块琼脂培养基平板，作为阳性对照。

3. 取未接种的2块琼脂平板作为阴性对照。

4. 取供试品0.5-1.0ml，接种于支原体液体培养基中，置36℃±1℃培养21天。

5. 取100cfu的口腔支原体或肺炎支原体接种于肉汤，作为阳性对照。

6. 取未接种的2管肉汤培养基，作为阴性对照。

7. 于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体琼脂培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。

8. 置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。使用倒置显微镜在x100放大倍数下观察培养后的琼脂平板以检测支原体菌落的存在。

9.  镜检观察时，在同一视野下应注意区分气泡、支原体菌落或者细胞残渣。支原体菌落成煎蛋状；两个可见的圆圈，一个在另一个里面。气泡虽然也是圆圈，但是并不凸起，且在特定角度下，中间可透光。如下对比图。

支原体

培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

虽然培养法被喻为支原体检测的“金标准”，但在支原体分离培养的过程中，要长出明显的克隆至少需要4周的时间。对于有效期较短的产品，诸如Car-T、细胞治疗以及基因治疗等，28天的检测时间显然过于漫长，无法满足其快速检测放行的需求。因此，如何能够快速、准确的进行支原体检测，势必成为这类企业关注的重点。

随着分子生物学技术的发展，PCR技术已经被应用于支原体污染的检测。该技术是根据支原体16s rRNA的保守序列设计引物，对目标样品DNA进行扩增，从而分析样品是否有支原体污染。PCR的方法操作简便、结果准确、速度快，通常只需3个小时左右即可得到结果。鉴于其优势，近年来PCR方法已经成为主流的支原体快速检测放行方法。

普通PCR是对样品DNA进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，通过与目标条带大小比对来判断是否有支原体污染。由于引物和PCR体系的不同，其准确度和灵敏度也千差万别。

荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量和定性分析。因此qPCR的检测灵敏度和准确度更高。

荧光定量PCR有染料法和探针法两种不同的检测方法。其中，染料法（SYBR Green法）是在PCR反应体系中加入SYBR Green的染料，染料在游离的状态下不发荧光，随着反应的扩增，染料与双链DNA结合，激发荧光，通过对荧光信号的检测即可得出样品中目标DNA的含量。但是，由于SYBR会无差别的与所有双链DNA结合发出荧光，因此其特异性相对较差。需要在PCR扩增结束之后，通过溶解曲线对全部PCR产物的TM值进行分析来判断产物是否唯一。因此，用染料法进行支原体污染检测，所需时间相对较长。

而基于TaqMan®探针法的qPCR，在反应体系中除引物外，增加了一个高特异性的探针，探针两端分别带上了荧光基团和荧光猝灭基团，在游离状态下不发光。随着PCR反应的进行，Taq酶会切断探针，从而使荧光基团释放而发出荧光，荧光信号的积累与DNA产物形成完全一致。因此，利用TaqMan®探针法的qPCR可以灵敏、准确的对样品中的支原体污染进行检测，避免出现假阳性的结果，确保实验结果准确、可靠。

综上所述，关于支原体检测的方法和技术在逐渐更新和逐步完善，目前新的PCR技术在国外已经相对比较成熟，如果大家有兴趣的话，借此机会尝试一下。