案例分享 | 支原体检测法详解-指示细胞培养法和qPCR法对比

指示细胞培养法，即采用能与DNA结合的荧光染料将细胞培养物染色。通过细胞表面荧光着色的特异性颗粒或丝状物对支原体进行检查，如果污染严重的话，在感染细胞的周围也会出现荧光转色。细胞质中线粒体也可以被染色，但很容易区别于支原体。指示细胞培养法实验操作相对复杂，相比其他方法，结果更直观，耗时约7天左右，但灵敏度低，假阳性率高。

指示细胞培养法操作步骤概述，即为将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。

细胞实验操作

用指示细胞法进行样品支原体检测时，取培养好的Vero细胞，用胰酶-EDTA溶液进行消化，使贴壁细胞形状由不规则变成圆形。将细胞制成105/ml的悬液，加入6孔细胞培养板，添加物抗生素培养基后，于5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养过夜。将供试品加入指示细胞板中，置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3-5天。指示细胞培养物至少传代一次。末代传代的细胞用二苯甲酰胺荧光染料进行染色后，在显微镜下进行观察。同时用无抗生素培养基和已知阳性的标准菌种进行同法操作，分别作为阴性和阳性对照。若视野中仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光，则检测结果为阴性。若显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒，则检测结果为阳性。

 左为无污染细胞；右为支原体污染细胞

虽然指示细胞法可以比较直观的观察支原体污染，但是其操作复杂，对操作人员的专业技能要求高，整个检测过程需要7天左右。而且对于指示细胞，需要被证明无支原体污染，以防出现假阳性的风险。此外，指示细胞法灵敏度较低，极易出现假阳性或假阴性的风险，因此，每次检测过程需要观察多个视野，人员因素对结果的影响大。另外，阳性对照支原体具有传染性和危险性，操作时应谨慎小心。

相较之下，PCR的检测方法耗时短，仅需3-4个小时即可得到检测结果。而且操作简便，容易形成标准化检测流程，避免了由人员差异对检测结果的干扰。

基于TaqMan®探针法的qPCR，在反应体系中除引物外，增加了一个高特异性的探针，荧光信号的积累与DNA产物形成完全一致。因此，利用TaqMan®探针法的qPCR可以灵敏、准确的对样品中的支原体污染进行检测，避免出现假阳性的结果，确保实验结果准确、可靠。

在进行qPCR检测时，qPCR反应体系可能会对扩增反应造成抑制，从而干扰qPCR反应，带来假阴性风险。为了避免假阴性结果，应当在qPCR体系中添加内参基因。内参基因可以与待测基因共同扩增，用内参基因来评判qPCR反应体系是否正常。 

此外，用支原体阳性标准品作为阳性对照，从而评判qPCR扩增循环过程是否正常，从而消除由于反应条件抑制导致的假阴性风险。同时，鉴于支原体有传染和致病的风险，为了保护操作人员免受危害，阳性标准品应当为灭活的冻干粉，消除其传染性。

用于终产品支原体放行检测时，还应依据药典的要求，进行方法适用性验证。目前，欧洲药典EP2.6.7对用分子生物学进行支原体检测的方法验证以及支原体标准菌株进行了详细的说明，可参考其内容对检测方法进行评估。 

综上所述，关于支原体检测的方法和技术在逐渐更新和逐步完善，目前新的PCR技术在国外已经相对比较成熟，如果大家有兴趣的话，借此机会尝试一下。