BiologicsHOS - 蛋白质高阶结构指纹图谱分析

在采集方面的进展

原子分辨率水平上HOS的NMR评估涉及测量大型生物分子的2D甲基指纹图谱。为此，我们使用50% NUS的2D 1H-13C ALSOFAST-HMQC来缩短光谱采集时间。如有需要，使用添加到AF-HMQC中的新SIERRA过滤器¹以选择性去除赋形剂信号。在600 MHz、5mm CryoProbe、2D 1H-13C AF-HMQC和50% NUS下的示例如下：

• 170 kDa完整mAb，0.3毫摩尔，7.5小时（有SIERRA）

• 60 kDa完整蛋白质，0.4毫摩尔，在800 MHz下90分钟（无SIERRA）采集时间：减少约30%。

  
  

峰值位置变化

信号位置对样本的HOS敏感。为跟踪监控模式下的变化，参考样本的峰值列表被传输到测试频谱，并测量峰值位置的变化。这些峰值位置变化组合成一个数字，CCS。参考频谱和测试频谱中峰值位置之间的CCSD（组合化学位移差）²跟踪报告HOS变化的峰值位置变化。

图1：化学位移差跟踪峰位的变化。

它们显示在两张不同的图中：一张图中只显示位移，而另一个图中则结合了振幅比。

频谱的逐点比较

ECHOS（HOS的易比较性）³是对两个频谱进行逐点比较的一种简单方法。如果在至少一个频谱中，强度高于噪声阈值，则对感兴趣区域中的所有点进行比较。执行线性回归。为了便于比较，将显示残差，以便突出显示差异。

图2：ECHOS图对比NIST mAb与修饰后的NIST mAb。

从左到右：要比较的重叠频谱；线性回归结果；重叠频谱顶部突出显示差异。典型模式在回归图中可见，例如，在本例中的一个缺失峰值。

批次间变化

允许的批次间差异需要进行统计分析。PCA（主成分分析）是一种常用的、稳健的无监督降维方法。它在数据集中搜索变量。峰值列表（CCS）、bin或整个频谱都可以用作分析的输入。虽然基于CCS的统计数据通常已被很好地分离，但是使用整个频谱可能会显示出额外的变化。

图3：NIST MAB的HSQC频谱的PCA分析显示，根据温度，分值图中有一个清晰的分组。负载图允许识别回应信号。数据取自NIST协调的实验室间研究。⁴

总结

• 天然丰度下完整生物制药的HOS常规评估。

• 2D频谱的指纹显示原子分辨率水平的差异。

• 新开发的Mestrelab/Bruker SW软件可提供对HOS的便捷评估。

  
  

欲了解更多信息以及测试版软件，请联系biologicsHOS@bruker.com

1. Arbogast、Luke W等；Journal of Biomolecular NMR（《生物分子核磁共振杂志》）（2018）72:149–161

2. Amezcua、Carlos A.等；Journal of Pharmaceutical Sciences（《医药科学杂志》）102.6（2013）：1724-1733。

3. Arbogast、Luke W等；Analytical Chemistry（《分析化学》）87.7（2015）：3556-3561

4. Brinson、Robert G.等；mAbs，11:1（2019），94-105

布鲁克提供全球最丰富的NMR和EPR波谱仪及临床前影像MRI研究工具。选择创新，选择诚信和信念，选择布鲁克。