安捷伦色谱技术小讲堂009--峰展宽原因分析

峰展宽原因分析

一、样品过载

当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现展宽，拖尾。由样品过载引起的峰展宽，解决方案就是减少进样量，图 1 显示了分别用 2、5 和 10 μL 进样得到的结果，可以看出随进样体积增加色谱峰是如何变宽的。这种问题一般在使用小体积色谱柱是表现更为明显，所以色谱柱方法从常规250mm或150mm长色谱柱转化到体积较小的快速分析柱时，进样量要按照柱体积的减小的比例而减小。

图1

二、数据采集速率设置

使用小体积色谱柱时，数据采集速率是“人为”峰展宽的常见原因。对于快速洗脱的色峰，要确保在色谱峰上收集到足够的数据点，数据系统才能准确测定出峰宽、峰面积和保留时间。如果得到的数据点太少（如，低数据采集速率），色谱峰就会显得比其实际要宽。您应该检查数据采集速率，确保其设置正确，以优化色谱结果。图 2 说明了不同数据采集速率对 Poroshell 120 EC-C18 4.6 x100 mm 上峰柱效影响。

图2

三、系统中的管线外体积

较大的柱外死体积会导致峰展宽。图3中对比了不同内径管线对峰型的影响，明显看到所有的峰都展宽了。建议优化系统的连接管线，更换为较短管线；如果使用的是高效柱，将内径 0.18 mm 的绿色管线换成内径 0.12 mm 的红色管线。如果您使用的是较小的高效柱，如 Poroshell 120 和亚-2μm粒径柱，您就要尽可能地减少柱外体积，以免其影响您的色谱结果。不必要的柱外体积可能导致柱效损失，有时还会造成拖尾。

图3

第四、延迟体积

延迟体积，又称驻留体积。低压混合系统的延迟体积等于从比例阀经泵和其它系统组件到柱头的体积总和。高压混合系统的延迟体积等于从各溶剂首次接触，经两个计量泵再到柱头的体积总和。在梯度分离中，延迟体积对峰型影响很大。梯度开始时出现一段等度时间，相当于延迟体积除以流速。延迟体积太大的仪器不能进行窄径梯度分离。

图4 中的色谱图例说明了延迟体积对分析结果的影响。请注意，前面的洗脱峰较宽。问题在于驻留体积使前面的峰出峰较晚，基本上是被等梯度洗脱的。如果这种情况影响了分离或检测，就需要减少驻留体积或使用另外的系统。

图4

第五、色谱柱污染

在开始时没问题，在使用一段时间后出现峰展宽，可能是由于污染引起的，而且几乎所有的峰都有不同程度的展宽。这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。

第六、保护柱失效

如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰型变差等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过 10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。

第七、色谱柱键合相流失或柱塌陷

色谱柱键合相流失和柱塌陷通常在谱图上表现出柱效下降，峰展宽或拖尾。

如果流动相pH超标或在色谱柱pH耐受范围临界点附近长时间使用，是比较容易造成硅胶填料溶解塌陷。如果出现色谱柱塌陷，您会看到色谱图中的每个峰峰形都会发生变化（峰拖尾、展宽或分叉）见图5，这类问题很难修复，短时间内可以反方向运行，建议直接更换色谱柱。日常使用的过程中注意将温度降低到 40 ℃ 以下，特别是使用高 pH 流动相时；使用高温兼容色谱柱，如立体保护的硅胶柱、混合型柱、聚合物柱、氧化锆柱等。使用特别适合在较高 pH 下操作的高覆盖率或双交联固定相（比如，ZORBAX Extend-C18），或使用聚合物、混合型或氧化锆反相柱。

图5

第八、色谱柱性能下降

在您使用色谱柱时，会用其分析各种目标物、使用各种流动相并分离不同的样品基质，经过长时间的使用，色谱柱会受到这些物质的影响发生一些微妙的变化，从而引起峰展宽、拖尾或保留时间的改变。在使用新色谱柱时保留其测试样品色谱图非常重要，在使用一段时间后进行比较，就能发现性能上的变化。如果分离度下降导致不能进行良好定量，这根色谱柱就应该丢弃并更换了。