内毒素检测的演变：重组试剂与鲎试剂的比较

细菌内毒素检测（BET，Bacterial Endotoxin Testing）已使用鲎试剂进行了数十年，该溶解物来源于鲎血。该检测通过检测革兰氏阴性菌产生的脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）内毒素来实现，对于药品、医疗器械和生物治疗产品的放行至关重要。最近，制药和生物技术行业已转向重组（如：合成）替代品，这些替代品在内毒素检测方面保持了等效的灵敏度和特异性，同时减少了对物种鲎的影响。

目前市场上有两种主要的重组试剂：重组C因子（rFC，recombinant Factor C）和重组级联试剂（rCR，recombinant cascade reagent）。虽然这两种检测方法都利用合成生物学来复制天然凝血级联的内毒素检测机制，但它们在生化设计、检测动力学、监管接受度和实际应用方面存在根本性差异。本文对rFC和rCR方法与鲎试剂方法进行了全面比较，探讨了它们在作用机制、分析性能特征以及两种试剂的实际应用评价方面的差异。

传统的鲎试剂反应级联包含B因子、C因子、凝固酶原，以及在显色试剂的情况下，还包含变色底物。这种方法对内毒素和β-葡聚糖都敏感，β-葡聚糖可来源于酵母或霉菌。几十年来，鲎试剂一直是主要方法，直到2003年首次引入合成鲎试剂rFC。rFC仅模拟鲎试剂酶级联的一部分，即C因子。最近的替代品rCR包含完整的合成鲎试剂级联，并于2021年引入。本文件将比较rFC和rCR之间的关键差异。

rFC被开发作为鲎试剂的单因子替代品。rFC试剂含有鲎血液凝血机制中的第一个凝血酶，即C因子。rFC方法中使用的是C因子的合成克隆，它来源于圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）或三棘鲎（Tachypleus tridentatus）物种，并通过表达系统中的重组DNA技术生产。

rFC检测通过一种简化的检测机制进行，这与天然鲎试剂级联不同。当内毒素（LPS）与C因子结合时，它会诱导构象变化，从而激活酶的蛋白水解活性。活化的C因子随后裂解合成的荧光底物，释放出与样品中内毒素浓度成比例的荧光信号。

这种方法需要终点荧光检测，在测试开始和结束时读取。其工作原理是利用荧光检测仪，当检测到内毒素时，该仪器会放大荧光底物的信号。这种直接的单步反应有别于天然鲎试剂和rCR检测中存在的多酶级联反应。这种简化途径消除了级联机制固有的酶促放大效应，转而依赖于内毒素与信号生成之间1:1的化学计量关系。