最新4篇Nature实锤！MST破解CRISPR-Cas多元分子互作核心难题

2026-07-14 11:58:06, Beibei Liu 诺坦普科技（北京）有限公司

关键词：多元互作|蛋白核酸互作|MST

研究背景

在生命科学领域，CRISPR-Cas系统始终是研究热点。随着科学家不断发掘其新的功能机制与系统成员，CRISPR-Cas正持续推动基因编辑、分子诊断等领域的快速创新。CRISPR-Cas系统的功能实现通常涉多个分步结合事件以及高阶复合物的动态组装。以Cas12a3为例，Cas12a3蛋白与crRNA形成二元复合物，随后进一步识别并结合靶标RNA而被激活，最终再与底物tRNA形成四元复合物，完成对底物的切割。在此过程中，Cas12a3蛋白会发生动态构象变化，而这些变化往往与其功能激活和底物识别密切相关。

然而，这种高度动态且多组分参与的分子机制，也为CRISPR-Cas系统的互作研究带来了显著挑战：

1. Cas蛋白会形成二元、三元和四元复合物，复合物分子量通常较大，进行互作检测时需要保证其处于正确且具有生理相关性的结合构。对于依赖固定相的检测技术而言，固定过程可能影响复合物的天然构象，甚至限Cas蛋白在结合过程中的必要构象转变，影响检测结果。

2. RNA易降解，因此在实验过程中需要尽可能缩短检测时间，保证RNA完整性。

本文将结合今年发表在Nature及Nature biotechnology的4篇最新研究，探讨MST技术如何应对这些难题, 为CRISPR-Cas系统的机制研究提供高效、可靠的解决方案。

研究内容

德国维尔茨堡亥姆霍兹RNA感染研究所

Nature (IF=48.5)

2026年1月，德国维尔茨堡亥姆霍兹RNA感染研究所在Nature发表题为“RNA-triggered Cas12a3 cleaves tRNA tails to execute bacterial immunity”的研究文章，揭示了CRISPR-Cas系统的全新免疫机制：Cas12a3核酸酶识别靶标RNA后，优先特异性切割tRNA保守的3′-CCA尾端，通过破坏蛋白质翻译机器诱导细菌生长停滞，从而阻断病毒复制与传播。

文章解析了Ba1Cas12a3激活与tRNA切割的动态机制，获得四种关键状态的三维结构及构象变化：与 crRNA结合的二元复合物、与crRNA和靶标RNA 结合的三元复合物、与tRNA结合的预切割四元复合物以及tRNA尾部切割后的复合物，并通过MST技术来完成结构和功能验证。

图示：Ba1Cas12a3核酸酶活化及tRNA切割过程中的动态构象变化

MST检测Cas12a3三种不同复合状态下与RNA的结合亲和力，验证了其发挥功能的流程

研究发现，当靶标RNA与crRNA形成双链后，会进一步驱动Ca12a3发生构象重排（REC2 结构域偏移28 Å）和crRNA位移（crRNA的3''端PI结构域位移22 Å）。这类功能相关的动态构象变化，使传统依赖固定化策略的亲和力检测方法面临明显局限。

但MST技术可在溶液环境中直接开展检测，无需固定化处理，更有利于维蛋白及其复合物的天然活性状态，并允许分子在结合过程中自由发生构象变化。并且MST技术不依赖分子量，因此分子量较大的复合物也可轻松应对。MST检测一组K_d仅需10min，可以减少RNA的降解，获得更加准确的结果。

MST结果显示，Ba1Ca12a3蛋白可与crRNA高亲和力结合（k_d=0.2nM，蓝色曲线），形成RNP；RNP再与靶标RNA结合（k_d=5nM，橘色曲线）后被激活；三元复合物再与底物tRNA结合（k_d=20nM，绿色曲线），最终将tRNA尾部切除。此外，催化失活的Ba1Ca12a3（dBa1Ca12a3）三元复合物仍可与底物tRNA结合（K_d=6 nM，深绿色曲线）。

图示：MST技术检测Ba1Ca12a3蛋白可结合crRNA、靶标RNA和tRNA。 dBa1Cas12a3为E1065A催化突变体，无催化活性。

MST检测tRNA结构的影响

研究发现tRNA环的逐步消除并不影3′ CCA尾的切割。作者通过MST检测全长tRNA和截短tRNA h1（包含反密码子环、受体茎和3′ CCA的最小底物）均可与dBa1Cas12a3三元复合物发生结合。

图示：MST技术检测全长和截短tRNA结合dBa1Cas12a3三元复合物

MST在CRISPR-Cas系统互作上的成果可不止这一篇大作哦！一起来看更多案例↓

清华大学&北京大学

Nature (IF=48.5)

清华大学生命学院刘俊杰课题组联合北京大学生命学院白洋课题组和清华大学生命学院陈春来课题组在Nature杂志在线发表了题为“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究论文，使用MST技术检测PcrIIC1与apo-CbCas9、PcrIIC1和CbCas9–sgRNA以及PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之间的结合亲和力。(详见IF: 50.5！拆解Nature顶刊蛋白质与核酸互作发文思路)

图示：MST检测分析CbCas9和PcrIIC1结合的三个阶段

哈尔滨工业大学

Nature (IF=48.5)

哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组在Nature在线发表了题目为“Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein”的研究论文，使用MST检测SpyCas9–sgRNA复合物与AcrIIA2、AcrIIA4 与dsDNA亲和力。

图示：MST技术检测SpyCas9–sgRNA复合物与AcrIIA2、AcrIIA4 与dsDNA亲和力

厦门大学

Nature biotechnology (IF=41.7)

厦门大学生命科学学院刘亮教授课题组发表在Nature biotechnology上，题为“Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”的研究论文，通过MST技术研究Cas9-sgRNA-target RNA复合物对反式切割底物的序列偏好。(详见IF: 46.9|MST神助攻多元互作！)

图示：MST检测SpyCas9-sgRNA-TS复合物与poly(A)、poly(T)、poly(C)和poly(G)之间的相互作用

技术优势盘点

CRISPR-Cas系统的多元复合物状态及构象动态变化，显著提高了互作检测的技术门槛。而MST在溶液条件下检测，无需固定，检测速度快，不依赖分子量变化等特点能够有效应对此类体系在构象保持、复合物稳定性和检测时效性方面的挑战，这也正是越来越多高水平研究选择MST技术作为CRISPR-Cas 系统互作表征工具的重原因。

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参考文献

Dmytrenko O, Yuan B, Crosby KT, Krebel M, Chen X, Nowak JS, Chramiec-Głąbik A, Filani B, Gribling-Burrer AS, van der Toorn W, von Kleist M, Achmedov T, Smyth RP, Glatt S, Bravo JPK, Heinz DW, Jackson RN, Beisel CL. RNA-triggered Cas12a3 cleaves tRNA tails to execute bacterial immunity. Nature. 2026 Jan;649(8099):1312-1321. doi: 10.1038/s41586-025-09852-9 B1
Zhang S, Sun A, Qian JM, Lin S, Xing W, Yang Y, Zhu HZ, Zhou XY, Guo YS, Liu Y, Meng Y, Jin SL, Song W, Li CP, Li Z, Jin S, Wang JH, Dong MQ, Gao C, Chen C, Bai Y, Liu JG. Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity. Nature. 2024 Jun;630(8016):484-492. doi: 10.1038/s41586-024-07486-x
Dong D, Guo M, Wang S, Zhu Y, Wang S, Xiong Z, Yang J, Xu Z, Huang Z. Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature. 2017 Jun 15;546(7658):436-439. doi: 10.1038/nature22377
Chen J, Chen Y, Huang L, Lin X, Chen H, Xiang W, Liu L. Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding. Nat Biotechnol. 2025 Apr;43(4):558-568. doi: 10.1038/s41587-024-02255-7