ArrayJet生物芯片点样仪制备微阵列蛋白芯片助力蜱传脑炎病毒检测

蜱传脑炎，是一种由蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的，经蜱虫传播的传染病，呈现各种神经系统病症，目前尚无特效疗法。其诊断主要依赖于TBEV抗体检测，如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent ascept， ELISA）和免疫荧光试验（immunofluorescence assay， IFA）。

然而，蜱传脑炎病毒所属的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉反应，导致TBEV抗体检测的结果有偏差，例如检测中出现西尼罗河病毒（ West Nile virus ，WNV）的假阳性结果。因此急需找到一种高灵敏性和强特异性检测TBEV的方法。

1. 制备蛋白微阵列芯片

将TBEV、WNV、ZIKV（寨卡病毒）、USUV（乌苏图病毒）、JEV（日本脑炎病毒）、EDNV（登革热病毒）的EDIII和NS1蛋白，利用英国ArrayJet公司的Marathon系列微阵列生物芯片点样仪（新型号M系列）制备成蛋白微阵列芯片。

2. 血清样本与蛋白微阵列芯片杂交孵育

感染过或疑似感染过DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清，阴性血清分别与蛋白微阵列芯片杂交孵育，并用荧光生物芯片扫描仪获取杂交结果。

3. 蚀斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test ，PRNT）

将上述血清与病毒混合后孵育，然后加入预先形成的A549单层细胞中，观察并计数斑块形成情况。同时与蛋白微阵列芯片杂交结果比较。

NS1蛋白微阵列芯片结果呈现属内高度交叉反应

在NS1的蛋白微阵列芯片杂交结果中，所有的阴性血清都无免疫特异反应。来自感染过或疑似感染过上述病毒的患者血清杂交实验中，大部分血清都和相关抗原出现了免疫阳性结果，而且这些患者血清同时与属内其他病毒出现了阳性反应，这与此前报道的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉相一致。

免疫学检测金标准--PRNT的实验结果显示，NS1蛋白微阵列结果中出现的阳性结果在PRNT中都为阳性。在20例TBEV的患者血清实验中，除了蛋白微阵列芯片已经确认的7例之外，还有8份血清也呈现阳性。说明单独检测NS1抗原存在假阴性结果，因此基于NS1抗原的蛋白微阵列流程需要进一步优化。

TBEV EDIII的蛋白微阵列实验结果

为了提高蛋白微阵列检测的灵敏性和特异性，使用EDIII阳性血清（来自接种TBEV疫苗志愿者）和上述血清再次与EDIII蛋白微阵列芯片杂交。结果显示，之前的20份TBEV患者血清 EDIII杂交结果与PRNT结果完全一致——15份血清为阳性，5份为阴性。而这些血清样本对WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反应水平则比较低。这说明EDIII的确存在属内交叉反应，但TBEV的反应水平则远高于其他病毒。

正黄病毒属内病毒在血清学检测中的确存在高度交叉性，PRNT实验验证了这一结论。通过在蛋白微阵列芯片中联合使用TBEV NS1和EDIII抗原蛋白，可以提高TBEV检测的灵敏性和特异性，有助于在感染早期快速发现TBEV感染，争取治疗的窗口期。