【SPR互作问答】第6期：实验操作篇

前言

规范的实验操作是SPR数据可靠的核心保障。本期覆盖SPR全实验流程的16个高频问题，从实验准备、进样参数设置，到芯片再生、特殊实验操作，帮你掌握标准化操作流程，规避实验操作中的常见坑。

① 实验准备（芯片选择、缓冲液配制、样品制备）；

② 配体固定（共价偶联或捕获法，验证配体活性）；

③ 样品进样（预实验确定分析物浓度和再生条件）；

④ 芯片再生（去除残留分析物）；

⑤ 数据分析（传感图处理、参数拟合）。

① 芯片复温至室温（避免温度变化导致基线漂移）；

② 检查芯片表面是否清洁，无划痕或污染；

③ 确保流路系统已清洗，无残留样品或气泡；

④ 准备好运行缓冲液，已完成过滤和脱气。

① 进样时间：确保分析物充分结合，动力学实验通常需要120~180 s，小分子筛选可缩短至30~120 s；

② 解离时间：确保解离信号能反映真实速率，慢解离（kd<10⁻⁴ s⁻¹）需300s以上，快解离（kd>10⁻³ s⁻¹）需120s，小分子10~120 s；

浓度梯度设计需遵循以下核心原则：

① 浓度范围覆盖KD值的0.1~10倍，确保曲线有足够跨度；

② 至少设置5个分析物浓度点，另设零浓度和重复浓度对照；

③ 浓度梯度采用10倍以内稀释，避免跨度太大导致拟合不准确；

④ 高浓度需避免分析物聚集。

常用再生试剂及适用场景如下：

① 低pH试剂（10mM 甘氨酸-HCl，pH1.5~3.0）：适用于抗体、蛋白－蛋白互作；

② 高离子强度试剂（14M MgCl₂、0.55M NaCl）：适用于静电吸附的分析物；

③ 高pH试剂（1~100mM NaOH）：适用于核酸、脂类；

④ 螯合剂（EDTA）：适用于NTA芯片捕获的组氨酸标签蛋白。

选择原则：根据分析物与配体的结合方式，优先从温和条件开始筛选。

SPR实验核心对照类型及作用如下：

① 阳性对照：已知能与配体结合的分子，验证实验系统有效性；

② 阴性对照：已知不与配体结合的分子，评估非特异性结合；

③ 空白对照（缓冲液）：扣除仪器噪音；

免疫原性检测核心是检测血清中的抗药抗体（ADAs），特殊处理步骤如下：

① 血清/血浆样品酸性处理（pH1~2），使抗药抗体（ADAs）与药物复合物解离；

② 立即中和至生理pH，避免ADAs失活；

③ 中和后快速进样，防止ADAs与药物重新形成复合物。

原因：膜蛋白固定在脂质双层中，高流速可能破坏脂质双层结构，导致配体流失；低流速能维持脂质双层稳定，同时保证分析物与膜蛋白充分结合。

推荐流速：10~20μL/min。

① 阳性对照和阴性对照均匀分布在样品板中，监控实验稳定性；

② 避免 “黏性” 样品（如强结合小分子）连续进样，影响结合信号；

③ 相同浓度梯度的样品集中排列，减少仪器调整时间；

④ 零浓度对照间隔设置，校正基线漂移。

需验证4项核心指标，全部达标方可继续实验：

① 基线恢复：再生后信号回归基线，信号差异≤5%；

② 结合信号稳定：重复进样同一分析物，结合响应值变化≤10%；

③ 配体活性：分析物结合动力学参数无显著变化；

④ 无非特异性累积：多次再生后非特异性结合无明显升高。

二者核心操作差异与适用场景如下：

① 单循环动力学：一个循环中依次进样梯度浓度分析物，无需再生；优点是无需优化再生条件，节省时间；缺点是可能造成通道不可重复使用；

② 多循环动力学：每个浓度分析物单独进样，进样后再生；优点是数据稳定，再生后可重复进样，适合慢解离互作；缺点是需优化再生条件，耗时较长。

抗原表位作图用于判断不同抗体的结合表位是否重叠，核心操作步骤如下（此处介绍常用的夹心法）：

① 固定捕获分子（如抗体）到芯片表面；

② 捕获第一种抗体，封闭剩余捕获位点；

③ 进样抗原，与第一种抗体结合；

④ 进样第二种抗体，检测是否能同时结合抗原；

⑤ 再生芯片，重复测试不同抗体对；

⑥ 分析第二种抗体的结合信号，判断表位是否重叠。

【SPR互作问答】往期链接：

【SPR互作问答】第1期：核心原理篇

【SPR互作问答】第2期：仪器组件篇

【SPR互作问答】第3期：芯片选型篇

【SPR互作问答】第4期：配体固定篇

【SPR互作问答】第5期：缓冲液与样品处理篇