【SPR互作问答】第5期：缓冲液与样品处理篇

前言

缓冲液体系与样品制备，是决定SPR实验背景噪声、非特异性结合与数据准确性的关键环节。本期覆盖15个高频问题，从缓冲液配制、各类样品预处理，到基质干扰的规避方法，帮你从源头解决实验干扰问题。

① 维持配体和分析物的天然构象和活性（提供生理环境）；

② 控制溶液离子强度和pH，以及表面活性剂（如Tween）减少非特异性结合；

③ 作为样品和试剂的载体，确保液体流动顺畅；

④ 匹配样品折光率，减少本体偏移干扰。

SPR实验常用缓冲液及适用场景如下：

① HBS-ET缓冲液：适用于多数蛋白－蛋白互作，pH 7.4左右，生物相容性好；

② 磷酸盐缓冲液（PBS）：适用于小分子－蛋白互作，避免有机缓冲成分干扰小分子检测；

③ 醋酸钠缓冲液：适用于配体偶联时前以及正式偶联的溶剂静电预富集（pH 4.0~5.5）

作用是减少蛋白质等生物分子在流路系统中的吸附和沉淀，降低非特异性结合；常用浓度为0.05%（高于临界胶束浓度），如Tween 20。

会导致本体偏移（进样时响应值快速升降），干扰结合信号检测，尤其对小分子实验影响极大。解决方法：

① 用缓冲液稀释样品或透析置换缓冲液，匹配成分；

② 扣除参比通道信号；

③ 含高折光率有机溶剂稀释时采用溶剂校正。

动力学/亲和力测定要求纯度≥90%，避免杂蛋白干扰结合信号；筛选或浓度测定可适当降低（如≥70%），但需通过对照扣除杂蛋白影响。

① 用缓冲液溶解，必要时添加DMSO（≤10%）；

② 确保浓度准确，通过UV/重量法标定；

③ 过滤去除不溶物，避免颗粒干扰；

④ 与运行缓冲液匹配折光率和成分，做好溶剂校正。

① 离心（10000g，10min）或过滤去除聚集物；

② 用运行缓冲液稀释（通常1:10~1:100），降低基质干扰；

③ 免疫原性检测中需酸性处理（pH1~2）后立即中和，释放抗药抗体（ADA）。

需模拟生物膜环境，如用脂质体包裹膜蛋白，或在缓冲液中添加适量表面活性剂（避免破坏蛋白结构）；实验选用C5、L1或HPA芯片，形成脂质双层支持物。

作用是螯合管路中的微量二价金属离子，防止其影响分子活性；需避免在NTA芯片捕获组氨酸标签蛋白的实验中使用，EDTA会破坏金属螯合作用，影响捕获效率。

梯度稀释的两种核心方法及对比如下：

① 连续稀释法：以稀释后样品为母液依次稀释；优点是操作简便，缺点是误差累积；

② 平行稀释法：从母液直接取不同体积，加缓冲液定容至相同体积；优点是误差小，缺点是操作繁琐，需更多样品。

重复设置原则：

① 至少设置2次重复，评估检测方法稳定性；

② 重复样品单独分装，避免同一容器多次取样导致损耗；

③ 重复样品间隔放置，评估时间漂移影响。

评估方法：用相对标准偏差（RSD）衡量，RSD≤10% 为合格；动力学实验中多次重复的KD值变化≤20%。

【SPR互作问答】往期链接：

【SPR互作问答】第1期：核心原理篇

【SPR互作问答】第2期：仪器组件篇

【SPR互作问答】第3期：芯片选型篇

【SPR互作问答】第4期：配体固定篇