收藏！10年技术经验分享：蛋白组学实验10条高频问题，WB/质谱/IP实验疑难杂症一次性解决！

Western blot（WB）的核心优势在于信号能多级放大，而且特异性超强，基本不会被样本中复杂的背景蛋白丰度干扰；

而质谱检测遵循“高丰度优先”原则——低丰度蛋白的肽段信号很容易被高丰度蛋白“掩盖”，没法被有效捕获。

除此之外，还有两个关键原因：

① 生理/病理变化可能不依赖蛋白总表达量，而是由磷酸化、乙酰化等修饰后蛋白的水平决定；

② 若目标蛋白对应的肽段质量不佳，会直接导致质谱定量结果不准。

完全正常！这是科研中很常见的现象～

mRNA与蛋白质的表达水平并非“一一对应”，二者相关系数通常仅0.4~0.5。

蛋白的最终表达量，除了受mRNA调控，还会被转录因子、增强子/抑制子、DNA/RNA修饰、翻译效率、蛋白降解速率等多重因素影响，所以出现“反向趋势”很合理。

这是正常情况！同一蛋白在体内/体外可能发生修饰、剪切或降解，形成不同分子量的片段，反映在电泳图上就是不同位置的条带；

但质谱鉴定的核心是比对数据库中全长、无修饰的蛋白理论序列，这些不同形式的蛋白片段，最终都会指向同一个母本蛋白，所以分子量有偏差、不同条带对应同一蛋白都无需担心～

WB 能检测到条带，说明IP的捕获过程是成功的！按以下步骤排查即可：

① 先确认实验全流程质控合格，质谱仪运行状态正常；

② 若技术和仪器都没问题，核心原因大概率是目标蛋白丰度过低，信号被高丰度杂蛋白掩盖了。

可以在常规范围内适度放大筛选阈值尝试，但要注意：参数调整不一定能成功检出目标蛋白，反而可能影响其他蛋白的检测准确性～

发文章的话，建议直接用搜库软件推荐的默认参数，尽量不改动关键设置！标准化的参数是保证结果可信度和可重复性的关键，也更容易被期刊认可。

① 不能直接鉴定完全未知的蛋白！蛋白组学的检测原理是“已知数据库比对”，若要分析未知蛋白，建议结合基因测序等技术；

② 外源表达蛋白的解决方案很简单：把该蛋白的氨基酸序列添加到搜库数据库中，再进行质谱数据分析，就能有效鉴定啦～

通常会过滤掉，不建议纳入后续分析！

一般设置的过滤阈值是：缺失值占比超过33%（即3个重复中≥1个无数据）的蛋白，会被判定为表达数据随机性强、可信度低，强行分析也难得到有意义的结论，无需重点关注。

① 优先选与实验研究背景高度相关的差异蛋白！针对性更强，验证效率也更高；

② 理论上所有蛋白都能用PRM验证，但受限于蛋白丰度——丰度过低的蛋白，肽段信号难以被质谱有效捕获——所以挑选时，还需结合唯一肽段数量（Unique Peptides）和质谱打分情况，进一步评估低丰度蛋白。

差异蛋白筛选的核心指标是T检验p值和倍数变化（FC 值），常规标准如下：

• 标记定量产品：FC＞1.2 或 FC＜0.83，且 p＜0.05；

• 非标记定量产品：FC＞1.5 或 FC＜0.67，且 p＜0.05。

实际操作中可根据实验需求适当放宽/收紧，但建议控制在检测结果总数的20%以内，5%~10%为最优区间——既能保证差异蛋白的可靠性，又能满足后续分析需求。

① “有无蛋白”的判定标准（需同时满足）：

② 差异蛋白是否包含？

包含！这类蛋白是差异蛋白的重要组成部分，完全可以关注和利用～若后续通过WB、ELISA等手段验证，发现并非真实的有无差异，也不代表检测结果矛盾，只是不同技术的检测灵敏度和特异性存在差异而已。