客户文章 | 又一合作顶刊发表！华中科技大同济医院IF 14.1代谢+转录+疾病模型成果，发掘肝炎治疗新靶点！

代谢相关脂肪性肝病（MASLD）已成为全球重大健康挑战，影响超过30%的成年人群，其中20-30%会进展为代谢相关脂肪性肝炎（MASH）。MASH以肝细胞脂肪变性、小叶炎症、气球样变和纤维化为核心病理特征，显著增加肝硬化、肝细胞癌及肝衰竭的发病风险，给全球医疗系统带来沉重负担。目前针对MASH的药物治疗选择有限，FDA批准的甲状腺激素受体β激动剂Resmetirom仅在25-30%的患者中实现全面组织学应答，而GLP-1受体激动剂semaglutide 主要通过系统性代谢获益改善肝组织学，缺乏直接抗纤维化作用，现有治疗均存在明显局限性。

越来越多的证据表明，细胞外基质（ECM）重构不仅发挥支架功能，还通过机械传导和受体介导的信号通路调控肝细胞功能，参与脂质代谢紊乱和MASH病理进程。整合素β3（ITGB3）作为ECM与细胞间信号传导的关键跨膜受体，已知可通过激活肝星状细胞促进肝纤维化，且在动脉粥样硬化过程中调控内皮细胞损伤和血管壁脂质沉积，但能否通过非经典膜支架功能直接调控肝细胞脂质代谢，其潜在分子机制尚未明确。这一科学缺口为深入探究MASH发病机制、寻找新型治疗靶点提供了重要方向。

转录组/代谢组分析、细胞与动物功能验证、Co-IP/IP-MS等分子机制探究、基因沉默（AAV-shITGB3）与药物抑制（cyclic-RGDfk）治疗验证。

MASH（代谢功能障碍相关脂肪性肝炎）患者和高脂饮食（HFD）、高脂高胆固醇（HFHC）饮食喂养及db/db等小鼠模型的肝脏中，肝细胞的ITGB3（整合素β3）表达均显著上调，且其mRNA和蛋白水平与疾病严重程度、脂质积累呈正相关；对公共转录组数据集的GSEA分析显示MASH患者肝脏ECM（细胞外基质）相关基因特征上调，HFD 来源的肝脏ECM处理AML-12肝细胞可显著增加细胞内脂质和甘油三酯积累，整合多组转录组及GWAS数据并经机器学习分析确认ITGB3是与MASH进展关联性最强的核心ECM相关基因，免疫荧光染色证实ITGB3高表达特异性定位于肝细胞，体外棕榈酸（PA）处理HepG2肝细胞也能诱导ITGB3的mRNA和蛋白表达升高。

图1. 人及小鼠MASH肝脏中ITGB3表达上调

腺相关病毒（AAV）介导肝细胞特异性过表达整合素β3（ITGB3）的C57BL/6J小鼠，在高脂饮食（HFD）喂养下，体重和肝脏重量显著增加，附睾白色脂肪组织（eWAT）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）Depot扩张，血清和肝脏中甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平升高，葡萄糖耐量受损；肝脏组织经H&E、油红O、天狼星红及F4/80染色显示，脂肪变性、胶原沉积和促炎髓系细胞浸润加重，脂质代谢、炎症及纤维化相关基因（Fasn、Tnfa、Clo3a1 等）转录上调，证实肝细胞ITGB3过表达会加剧HFD诱导的肝脂肪变性、代谢紊乱及肝损伤。

图2. 肝细胞特异性ITGB3过表达促进高脂饮食（HFD）诱导的肝脂肪变性

通过将ITGB3 floxed小鼠（FLOX）与白蛋白-Cre小鼠杂交获得肝细胞特异性ITGB3敲除小鼠（HKO），在高脂饮食（HFD）和高脂高胆固醇饮食（HFHC）诱导的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）模型中，HKO小鼠体重、肝脏重量及脂肪组织比例均低于FLOX对照，二氧化碳产生、氧气消耗和产热等代谢参数改善，血清和肝脏中甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平降低，胰岛素敏感性提升；肝脏组织病理染色显示脂肪积累、炎症浸润和纤维化显著减轻，脂质代谢、炎症及纤维化相关基因转录下调，表明肝细胞特异性敲除ITGB3对MASH具有保护作用。

图3. 肝细胞特异性ITGB3敲低改善高脂饮食（HFD）及高脂高胆固醇饮食（HFHC）诱导的MASH

代谢组学分析显示，高脂饮食（HFD）喂养的肝细胞特异性ITGB3敲除小鼠（HKO）肝脏中长链脂肪酸（LCFAs）水平低于FLOX对照，BODIPY C16荧光追踪实验证实HKO小鼠肝脏及原代肝细胞的脂肪酸摄取减少，而HepG2细胞过表达ITGB3后脂肪酸摄取增加；免疫共沉淀（Co-IP）实验表明ITGB3与CD36直接相互作用，且不影响CD36总蛋白水平但促进其膜定位，酰基生物素交换法（ABE）检测显示ITGB3过表达增加CD36棕榈酰化、敲除则降低；进一步实验发现ITGB3增强CD36与棕榈酰转移酶DHHC5的相互作用，沉默DHHC5（siDHHC5）可逆转ITGB3过表达诱导的CD36膜定位和脂质积累，证实ITGB3通过DHHC5介导的CD36棕榈酰化调控肝脏脂质摄取。

图4. ITGB3通过DHHC5促进长链脂肪酸摄取及CD36棕榈酰化

向肝细胞特异性ITGB3敲除小鼠（HKO）尾静脉注射DHHC5过表达腺相关病毒（AAV-DHHC5），在高脂饮食（HFD）喂养下，HKO小鼠原本的体重优势消失，肝脏重量、肝脏与体重比及脂肪组织比例升高，血清甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及肝脏TG水平显著增加，氧气消耗、二氧化碳产生和产热等代谢参数降低；肝脏组织病理染色显示，脂肪变性、炎症浸润和纤维化程度较注射空载体的HKO小鼠明显加重，CD36棕榈酰化水平升高，表明恢复DHHC5表达可逆转ITGB3敲除对MASH的保护作用。

图5. DHHC5回补恢复肝细胞特异性ITGB3敲除（HKO）小鼠的高脂饮食（HFD）诱导肝脂肪变性

免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定发现LYN激酶是ITGB3和DHHC5的共同相互作用蛋白，形成三元复合物，且LYN过表达会抑制DHHC5与CD36的结合；HepG2细胞中，ITGB3敲除增加LYN蛋白稳定性、过表达则促进其蛋白酶体降解（环己酰亚胺（CHX）追踪实验证实），蛋白酶体抑制剂MG-132可挽救该降解，且ITGB3增强LYN的K48连接泛素化；进一步研究显示ITGB3通过FAK信号促进LYN的Y397酪氨酸磷酸化，Y397突变（Y397F）会抑制LYN泛素化，而Y397D磷酸模拟突变体可增强DHHC5与CD36的相互作用，在ITGB3过表达细胞中过表达野生型LYN可降低CD36棕榈酰化和脂质积累，突变体则无此效果，证实ITGB3通过促进LYN降解解除其对DHHC5的抑制，进而调控CD36功能。

图6. ITGB3介导的LYN稳定性调控CD36棕榈酰化及后续脂质摄取

在高脂饮食（HFD）喂养的C57BL/6J小鼠中，通过腺相关病毒介导的肝细胞特异性ITGB3敲低（AAV-shITGB3）或ITGB3特异性抑制剂环状RGDfk（cyclic-RGDfk）处理，小鼠体重、肝脏重量显著降低，血清和肝脏中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）水平下降，葡萄糖耐量改善；肝脏组织H&E和油红O染色显示脂肪变性程度减轻，NAFLD活动评分（NAS）及脂质积累面积降低，免疫印迹检测证实CD36棕榈酰化水平显著下调；其中环状RGDfk处理在疾病晚期（HFD 喂养16周后）仍能改善肥胖、血脂异常及肝脏炎症，且未出现明显肝肾功能异常，表明靶向ITGB3的基因沉默和药物抑制均能有效改善MASH。

图7. 靶向ITGB3治疗减轻MASH

该研究发现整合素β3（ITGB3）在人类及小鼠MASH肝组织中特异性上调，肝细胞特异性ITGB3过表达会加剧饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗、肝脂肪变性及纤维化，敲除则可缓解这些表型；其机制为ITGB3通过促进LYN激酶的K48连接泛素化降解，解除LYN对DHHC5的抑制，形成ITGB3/DHHC5/CD36复合物，增强CD36棕榈酰化及膜定位，加速长链脂肪酸摄取；通过AAV介导的ITGB3基因沉默或特异性抑制剂cyclic-RGDfk干预，可有效改善MASH表型，证实ITGB3是MASH的新型治疗靶点。