液-液相分离：从细胞组织理论到可定量验证的生物物理过程

2026-04-23 16:35:36, 景辉丹纳赫生命科学

引言：LLPS研究的核心问题不是“是否看到液滴”，而是“是否证明相变”

过去十余年，液-液相分离（Liquid–Liquid Phase Separation，LLPS）已从一个边缘概念迅速发展为细胞生物学、转录调控与神经退行性疾病研究中的核心理论框架。然而，在大量研究实践中，一个反复被顶级综述强调的误区是：将细胞内出现的“圆形荧光斑点”直接等同于相分离结构。事实上，从严格的生物物理学定义出发，LLPS并非形态学现象，而是一个可被热力学与动力学参数验证的相变过程。

这一理论转折的关键实验基础来自对P granules的活体研究：研究者通过实时成像观察到这些结构具有融合、流动及形变等典型液滴行为，从而提出细胞内某些无膜结构本质上属于液态凝聚体，而非静态聚集物^[1]。这一发现标志着细胞组织学从“膜分隔模型”向“相变组织模型”的重要扩展。

图源：doi: 10.1146/annurev-cellbio-100913-013325

随后，Hyman、Brangwynne与Jülicher系统提出：生物大分子可通过相分离形成生物分子凝聚体（Biomolecular Condensates），从而在无膜条件下实现空间生化反应分区^[2]。因此，从研究范式角度看，LLPS并非单一结构发现，而是细胞组织原则的理论重构。

一

LLPS的生物物理本质：从分子聚集到相变体系的严格区分

在实验语境中，蛋白聚集（protein aggregation）与相分离（phase separation）常被混用，但二者在物理机制上存在根本差异。聚集通常对应不可逆的能量最低态过程，而LLPS则属于可逆的相变行为，其形成依赖于体系跨越饱和浓度（saturation concentration, Cs）后进入双相共存状态。

从热力学角度，LLPS体系可用相图（phase diagram）描述，其中蛋白浓度、温度、离子强度及分子价数共同决定是否进入dense phase与dilute phase共存区域。Shin与Brangwynne指出，细胞内凝聚体在本质上遵循高分子物理中的液相分离规律，其驱动力主要来源于多价弱相互作用（multivalent weak interactions），而非单一高亲和力结合^[3]。

图源：doi：10.1126/science.aaf4382

在分子层面，内在无序区（Intrinsically Disordered Regions, IDRs）被认为是驱动相分离的重要结构基础。由于IDRs缺乏稳定折叠结构，其高度柔性允许形成瞬时、动态的相互作用网络，从而促进液态凝聚体的形成^[4]。

典型研究表明，FUS等RNA结合蛋白可在生理条件下形成液态凝聚体，并在时间或突变作用下发生液态向凝胶甚至固态转变，这一“液–固相变”过程被认为与ALS等神经退行性疾病密切相关^[5]。这进一步说明，LLPS不是简单的结构富集，而是具备明确物理状态演化路径的相变体系。

图源：10.1016/j.cell.2015.07.047

Banani等人提出的Scaffold–Client模型则从功能维度解释了凝聚体的分子选择性：Scaffold分子提供相分离驱动力，而Client分子被动态招募进入凝聚体，从而实现生化反应的空间富集^[6]。这一框架使LLPS从“结构现象”上升为“细胞生化组织机制”。

图源：doi：10.1038/nrm.2017.7

二

如何在实验上严格证明LLPS：判据体系、方法学逻辑与学界争议

随着相分离研究的快速扩展，顶级综述开始反复强调一个关键问题：大量研究仅基于形态学液滴观察即宣称LLPS，缺乏动力学与物理证据支持。McSwiggen等人在系统评估中明确指出，细胞内斑点结构并不能作为相分离的充分证据，必须结合多维实验判据建立完整证据链^[7]。

首先，分子交换动力学是区分液态凝聚体与不可逆聚集体的核心指标。FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）实验通过漂白局部区域并监测荧光恢复过程，可直接反映分子在凝聚体内外的交换速率。液态凝聚体通常表现为显著且可拟合的恢复曲线，而固态聚集体则表现为低恢复或不可恢复信号。Taylor等人的研究进一步指出，不同恢复动力学参数可用于量化凝聚体的粘弹性状态及内部流动性^[8]。

图源：10.1016/j.bpj.2019.08.030

其次，浓度依赖性验证是相变体系的重要判据。真正的LLPS应表现出明确的临界浓度阈值，当体系浓度低于Cs时保持均相分布，而超过阈值后迅速形成液滴结构。这一特征在多种体外重构实验中得到重复验证，并被视为相分离区别于随机聚集的重要依据^[2]。

第三，融合行为与形变动力学提供了直接的物理证据。液态凝聚体在接触后会快速融合并恢复球形，其过程由表面张力驱动；而固态或凝胶态结构则通常无法发生完全融合。Brangwynne对P granules的定量分析首次在活细胞水平验证了这一液体行为^[1]。

图源：10.1126/science.1172046

此外，化学干预实验（例如 1,6-hexanediol，简称 1,6-HD）在早期研究中常被用作“快速溶解液态凝聚体”的经验性工具，但它并不具备“LLPS特异性”：1,6-HD会影响多类分子相互作用与细胞过程（例如对激酶/磷酸酶活性、染色质运动等产生直接干扰），因此不能把“1,6-HD可溶解/不可溶解”当作单一判据来证明或否定LLPS。相分离研究界更推荐将1,6-HD视为“辅助扰动手段”，并要求与动力学与浓度依赖等证据共同构成判定链条^[9]。

三

成像与定量技术在LLPS研究中的决定性作用：从观察液滴到解析相变

在技术层面，LLPS研究对成像与定量分析平台的依赖显著高于传统细胞结构研究，其根本原因在于凝聚体具有高度动态性、尺度微小及物理状态可逆等特征。

首先，活细胞成像是解析相行为动力学的基础条件，而非可选技术。固定处理可能改变分子扩散状态并提高局部有效浓度，从而诱导非生理性凝聚体形成或抑制原有分子交换过程。系统评估指出，仅基于固定样本图像观察到的斑点结构无法区分液态凝聚体与稳定聚集体，这也是当前LLPS研究中最常见的误判来源之一^[7]。

其次，时间分辨率直接决定对相变过程的解析能力。凝聚体的融合、成熟（aging）及解聚过程通常发生在秒至分钟尺度，若时间采样不足，将无法捕捉关键动力学行为；而过高激发强度又可能诱导细胞应激，从而干扰真实相行为。因此，LLPS研究逐渐强调低光毒、长时程动态成像策略，以在维持细胞稳态的前提下获取可靠动力学数据。

第三，定量荧光分析确实是表征凝聚体（condensates）最常用、也最容易规模化推广的路线之一。实验上常见做法是用共聚焦/宽场成像分别测量 dense phase 与 dilute phase 的荧光强度，并以二者比值近似表征“富集程度”（常被称作 partition coefficient 的估计）。但需要注意：用荧光强度直接反推“真实浓度比/真实分配系数”会受到显著系统误差影响（例如点扩散函数、饱和、背景扣除、相界面体积效应等），因此这类指标更适合作为相对比较或与其他证据（FRAP、浓度依赖、融合行为等）组合使用，而不宜被当作单独的“定量终点”^[10][11]。

进一步而言，超分辨成像与单分子追踪技术正在揭示凝聚体内部的纳米尺度组织，使研究从“宏观液滴观察”迈向“分子尺度机制解析”。这一技术演进意味着，LLPS研究的可靠性不再取决于是否观察到液滴，而取决于是否能够建立多维定量证据链，包括动力学交换、浓度依赖性及物理行为一致性。

从方法学发展趋势看，相分离研究正在由概念驱动逐步转向技术驱动，即通过高分辨活细胞成像、动力学测量及多尺度定量分析，对相变过程进行可重复、可量化的系统研究。这一转变也解释了为何LLPS迅速成为细胞生物学、转录调控与疾病机制研究中的关键交叉领域。

结语

LLPS作为可定量研究对象的技术认知转型

液-液相分离的提出，使细胞生物学从静态结构描述进入以物理机制为核心的定量研究范式。其科学意义并不局限于发现新的无膜结构，而在于提供了一种可通过热力学参数、动力学实验及高分辨成像手段严格验证的细胞组织理论。

对于多数“听说过LLPS但未系统开展相关实验”的研究群体而言，真正需要建立的并非对“液滴现象”的认知，而是对相分离判据体系与技术方法学边界的理解。随着定量成像、动力学分析及多尺度数据整合技术的持续发展，LLPS研究正逐步从概念探索阶段走向标准化与定量化阶段，并将持续影响细胞生物学、神经科学及转化医学等前沿研究方向。

丹纳赫生命科学

提供液液相分离研究整体解决方案

参考文献

[1] Brangwynne CP, Eckmann CR, Courson DS, Rybarska A, Hoege C, Gharakhani J, Jülicher F, Hyman AA. Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science. 2009 Jun 26;324(5935):1729-32. doi: 10.1126/science.1172046. Epub 2009 May 21. PMID: 19460965.

[2] Hyman AA, Weber CA, Jülicher F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:39-58. doi: 10.1146/annurev-cellbio-100913-013325. PMID: 25288112.

[3] Shin Y, Brangwynne CP. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 2017 Sep 22;357(6357):eaaf4382. doi: 10.1126/science.aaf4382. PMID: 28935776.

[4] Wright PE, Dyson HJ. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Jan;16(1):18-29. doi: 10.1038/nrm3920. PMID: 25531225; PMCID: PMC4405151.

[5] Patel A, Lee HO, Jawerth L, Maharana S, Jahnel M, Hein MY, Stoynov S, Mahamid J, Saha S, Franzmann TM, Pozniakovski A, Poser I, Maghelli N, Royer LA, Weigert M, Myers EW, Grill S, Drechsel D, Hyman AA, Alberti S. A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell. 2015 Aug 27;162(5):1066-77. doi: 10.1016/j.cell.2015.07.047. PMID: 26317470.

[6] Banani SF, Lee HO, Hyman AA, Rosen MK. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 May;18(5):285-298. doi: 10.1038/nrm.2017.7. Epub 2017 Feb 22. PMID: 28225081; PMCID: PMC7434221.

[7] McSwiggen DT, Mir M, Darzacq X, Tjian R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes Dev. 2019 Dec 1;33(23-24):1619-1634. doi: 10.1101/gad.331520.119. Epub 2019 Oct 8. PMID: 31594803; PMCID: PMC6942051.

[8] Taylor NO, Wei MT, Stone HA, Brangwynne CP. Quantifying Dynamics in Phase-Separated Condensates Using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophys J. 2019 Oct 1;117(7):1285-1300. doi: 10.1016/j.bpj.2019.08.030. Epub 2019 Aug 30. PMID: 31540706; PMCID: PMC6818185.

[9] Düster R, Kaltheuner IH, Schmitz M, Geyer M. 1,6-Hexanediol, commonly used to dissolve liquid-liquid phase separated condensates, directly impairs kinase and phosphatase activities. J Biol Chem. 2021 Jan-Jun;296:100260. doi: 10.1016/j.jbc.2021.100260. Epub 2021 Jan 8. PMID: 33814344; PMCID: PMC7948595.

[10] Bergsma T, Steen A, Kamenz JL, Otto TA, Gallardo P, Veenhoff LM. Imaging-based quantitative assessment of biomolecular condensates in vitro and in cells. J Biol Chem. 2025 Feb;301(2):108130. doi: 10.1016/j.jbc.2024.108130. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39725032; PMCID: PMC11803855.

[11] Hubatsch L, Jawerth LM, Love C, Bauermann J, Tang TD, Bo S, Hyman AA, Weber CA. Quantitative theory for the diffusive dynamics of liquid condensates. Elife. 2021 Oct 12;10:e68620. doi: 10.7554/eLife.68620. PMID: 34636323; PMCID: PMC8580480.