大麻提取物中大麻二酚的模拟移动床色谱（SMB）纯化工艺开发

液相色谱在天然来源化合物纯化中的应用日益广泛，推动了模拟移动床色谱等连续纯化工艺的发展。与传统间歇工艺相比，该工艺生产效率更高、纯度更优、溶剂消耗更少。模拟移动床工艺于 1961 年由布劳顿与格霍尔德通过色谱柱联用首次开发，最初用于石油化工与制糖行业中传统技术难以实现的多项大规模分离。

如今，模拟移动床色谱在制药行业与精细化学品生产中作为分离技术的应用愈发广泛。从分离经济性来看，模拟移动床色谱相比传统间歇色谱具备多项优势，例如连续循环运行可节省洗脱剂并提升生产效率。模拟移动床工艺源于真实移动床色谱的理论概念，通过模拟固定相与流动相的连续逆流运动，实现混合物的连续分离与双组分萃取。

1. 样品前处理

大麻素标准溶液（1mg/mL，甲醇溶剂）为对照品，用乙醇稀释至指定浓度。样品为富含大麻二酚的大麻乙醇提取物，进样前经 0.20μm 聚四氟乙烯滤膜过滤。

2. 结果

2.1 样品前处理

大麻提取物分析显示，多种未知植物化学成分在大麻素之后洗脱（图 2，蓝色色谱图）。这些晚洗脱组分会显著延长模拟移动床工艺周期，因此通过预制备色谱步骤将早洗脱的大麻素富集为单一组分，去除大麻素峰后的植物化学成分（图 1）。以 100% 乙醇为溶剂，经分离收集大麻素组分（F1），重复多次纯化以获取足量大麻素样品用于后续模拟移动床实验。

预制备纯化后，样品按约 1:8 稀释（表 1）。将多次制备实验的合并馏分用旋转蒸发仪（97mbar，50℃）浓缩至原体积的 1/2。采用前文所述乙腈方法分析样品，色谱图显示制备步骤后，大麻萜酚（CBC）峰后的植物化学成分已被成功去除（图 2）。大麻二酚、大麻萜酚与 Δ9 - 四氢大麻酚（Δ9-THC）的测定浓度见表 1。

图2： 各大麻样品的叠加色谱图，峰1为CBD（大麻二酚），峰2为∆9-THC（Δ9‑四氢大麻酚），峰3为CBC（大麻萜酚）（蓝色：未处理样品；绿色：制备纯化后样品；黑色：浓缩后样品）

表1：不同样品中大麻二酚、Δ9 - 四氢大麻酚与大麻萜酚的浓度

2.2 模拟移动床参数测定

模拟移动床工艺的核心特点是多根相同色谱柱模拟一根大型色谱柱，因此所用色谱柱需具备一致的分离性能。本研究测试 9 根色谱柱，其中 8 根用于模拟移动床系统，1 根用于分析型系统测定参数。为评估色谱柱均一性、分离性能与效率，通过高效液相色谱系统测定弱保留物质（大麻二酚）与强保留物质（大麻萜酚）的保留时间与柱效，计算两者保留时间与柱效的均值、最大值与最小值（表 2）。7 号柱保留时间偏差最显著，大麻二酚偏差 1.26%，大麻萜酚偏差 1.84%。基于结果，选用 1、2、3、4、5、6、8、9 号柱开展模拟移动床实验。

表2：大麻二酚与大麻萜酚的保留时间、柱效及极值

对比半制备柱性能后，对预纯化大麻样品进行体积过载实验，确定不破坏线性吸附行为的最大柱载量（图 3）。进样体积≤100μL 时，峰形呈现近似线性吸附。20μL 进样的色谱图显示，大麻二酚保留时间 4.27min，Δ9 - 四氢大麻酚保留时间 7.32min。

图3：分析规模下的过载实验。样品为经纯化并蒸发浓缩的富含 CBD 的大麻提取物；进样体积：5 μL（蓝色），10 μL（红色），20 μL（黑色），50 μL（绿色），100 μL（黄色）；检测波长：228 nm色谱柱：ES II 100-15 C18（250×8 mm）；流速：4 mL/min

此外，计算模拟移动床方法参数还需萃余（Raffinate）组分、萃取（Extract）组分保留时间、半制备柱管路延迟时间与死时间。本研究以尿嘧啶为死时间标记物进行测定（图 4），色谱图显示无柱管路延迟时间 0.04min，有柱死时间 1.84min。

图4：含死时间标记物尿嘧啶的色谱图（100 μg/mL）。检测波长：228 nm；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×8 mm；进样量：5 μL；流速：4 mL/min

2.3 模拟移动床参数建立

基于预实验获得的保留时间（表 3）、色谱柱尺寸与流速，通过 Purity MCC 软件的模拟移动床计算器确定初始参数。体积过载实验中分析物在固定相上呈线性吸附行为（图 3），可应用三角形理论，计算器结果见图 5。

表 3 模拟移动床参数设计用保留时间

结合色谱柱参数与大麻二酚（Extract）、Δ9 - 四氢大麻酚（Raffinate）的保留时间，计算两者的亨利系数；通过管路延迟时间与死时间计算固定相孔隙率；根据色谱柱尺寸计算柱总体积，并测定管路体积与死体积。应用三角形理论确定四区参数范围。

图5：Purity MCC‑SMB 计算器界面截图，包含 SMB 初始参数，以及线性等温线对应的分离三角形

结合经验，将操作点选在三角形左下角（图 5，红点）。由于大麻二酚峰前存在杂质（图 3），选取尽可能小的 m_IV 值以保证流动相再生；针对晚洗脱的大麻萜酚峰（图 3），设置较高的 m_I 值以延长切换时间。基于 m 值计算各区流速，1 区流速经预实验设为 4mL/min；根据固定相移动速率、孔隙率与柱体积计算模拟移动床切换时间。

2.4 首次模拟移动床运行与方法优化

首次模拟移动床运行（方法 1，MO1）采用图 5 设定的初始参数，初期使用开环配置（open loop），洗脱剂不从 4 区循环至 1 区，直接排入废液。收集萃余液、萃取液与废液馏分，按单一切换周期或完整周期取样，经分析型HPLC检测。采用快速过程控制方法评估工艺，用前文乙腈方法定量。过程控制方法使用小内径色谱柱（ES II 100-15 C18 250×4mm），流速 1mL/min，进样体积 10μL。图 6（萃余液）与图 7（萃取液）为前 23 个循环（1~23循环）样品色谱图叠加，可快速评估分离效果。

图6：前 23 个循环萃余液样品的色谱图，峰1：CBD（大麻二酚）

图7：前 23 个循环萃取液样品的色谱图，峰1：大麻二酚（CBD）；峰2：Δ9‑四氢大麻酚（∆9‑THC）；峰3：大麻萜酚（CBC）

采用乙腈方法测定前 23 个循环萃余液中大麻二酚的浓度、回收率与纯度，结果见表 4。

表 4 前 23 个循环萃余液中 CBD 的浓度、回收率与纯度

测定结果显示，萃余液中大麻二酚浓度随循环次数增加而升高，3~4 循环后浓度仅微小波动，工艺进入稳态。同时，大麻二酚的回收率与纯度也随循环次数增加而提升。

在萃取液与萃余液出口前安装两台紫外检测器作为过程控制工具，紫外信号可反映工艺稳定性、是否崩溃及稳态到达时间（图 8、图 9）。

图9：第 1～10 个循环提取液出口处的紫外信号，MO2

萃余液与萃取液出口的紫外信号验证了表 4 结果，明确显示出口中大麻素浓度随循环数增加而升高，3 个循环后工艺趋近稳态，3~4 循环信号仅微小波动。

23个循环后三路出口与样品的色谱图见图 10，对比表明大麻二酚仅存在于萃余液，大麻萜酚与 Δ9 - 四氢大麻酚仅存在于萃取液。

图10：第 、23个循环时三路出口及原料样品的色谱图，1：CBD（大麻二酚）；2：Δ9-THC（Δ9‑四氢大麻酚）；3：CBC（大麻萜酚）。MO1；（黑色：原料样品；蓝色：萃余液；红色：提取液；绿色：废液。检测波长：228 nm；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×4 mm；进样量：10 μL；流速：1 mL/min）

与样品相比，收集的萃取液、萃余液与废液均出现稀释现象。23个循环各路出口中大麻二酚、大麻萜酚与 Δ9 - 四氢大麻酚的回收率见表 5。萃取液中可检测到 Δ9- 四氢大麻酚、大麻萜酚与痕量大麻二酚，废液中含少量大麻二酚与大麻萜酚，萃余液仅含大麻二酚。

表5：第 23个循环各出口中 CBD、CBC 与 Δ9-THC 的回收率（MO1）

废液中检出大麻萜酚，说明切换时间过短，未等晚洗脱组分完全洗脱即完成 1 区至 4 区切换，携带大麻萜酚的色谱柱进入 4 区，随流动相排入废液。因此将切换时间从 8.51min 延长至 8.60min（+0.09min），同时将 2 区流速从 2.202mL/min 提升至 2.250mL/min（+0.048mL/min），将萃取液中残留的大麻二酚转移至萃余液。收集 24~43 个循环的样品分析参数调整效果，第43个循环各路回收率见表 6。结果显示大麻二酚仍有效分离至萃余液，废液中无大麻二酚，但仍含大麻萜酚，萃取液中仍有痕量大麻二酚。

表6：第 43个循环各出口中 CBD、CBC 与 Δ9-THC 的回收率（MO2）

以大麻二酚为目标产物，废液中大麻萜酚的污染可接受，萃取液中少量大麻二酚损失可容忍。因此下一步改为闭环配置（closed loop），实现部分洗脱剂循环。闭环运行时，4 区部分洗脱剂持续回流至系统，第48个循环各路回收率见表 7。结果显示大麻二酚仍分离至萃余液，萃取液中大麻二酚可达定量水平。

表7：第48个循环各出口中 CBD、CBC 与 Δ9-THC 的回收率（MO3）

为提升工艺产能，将进料流速从 0.082mL/min 提升至 0.092mL/min，第65个循环各路回收率见表 8。两路出口均出现污染，因此终止工艺。表 9 汇总四种测试方法结果，仅统计目标产物大麻二酚的回收率与纯度。

表8：第65个循环各出口中 CBD、CBC 与 Δ9-THC 的回收率（MO4）

“方法 2（MO2）” 的大麻二酚回收率最优，约 90%，每个循环可从萃余液回收 42mg 大麻二酚，纯度约 93%。需注意方法2为开环工艺，方法3、4 为溶剂循环的闭环工艺，后两者因萃余液受大麻萜酚污染，分离效果略差。若可接受微量污染，方法 4 为更优选择。

表9：不同方法 SMB 工艺结果

纯化工艺的目标是最大化目标产物得率，优化方向有二：提升进料流速或使用更高浓度样品。提升流速导致萃余液污染（表 8），因此后续实验采用更高浓度样品。为适配模拟移动床系统，将萃取液样品再次浓缩至原体积 1/2，用乙腈方法分析，结果见表 10。

表10：不同样品中 CBD、Δ9-THC 和 CBC 的浓度

大麻素浓度数据显示，第二次浓缩后样品浓度为第一次浓缩后的两倍，新样品按约 1:2 稀释。后续SMB实验采用新样品与方法 2，第15个循环的各路出口与样品色谱图见图 11。

图11：第15次循环时三路出口及高浓度样品的色谱图。1：CBC（大麻色烯）；2：∆9-THC（Δ9‑四氢大麻酚）；3：CBC（大麻色烯）。MO2；

黑色：样品；蓝色：萃余液；红色：提取液；绿色：废液。检测波长：228 nm；色谱柱：ES II 100-15 C18 250×4 mm；进样量：10 μL；流速：1 mL/min

第15次循环中各路回收率见表 11，萃取液中可检测到 Δ9 - 四氢大麻酚、大麻萜酚与大麻二酚，废液中含少量大麻二酚与大麻萜酚，萃余液仅含大麻二酚。

表11：第15次循环各出口中 CBD、CBC 与 Δ9-THC 的回收率（MO2）

表12 汇总选定循环次数的结果，仅关注大麻二酚的回收率与纯度。方法 2 下大麻二酚回收率约 80%，第19次循环可从萃余液回收 95mg 大麻二酚，纯度约 93%。

表12：使用MO2 方法的SMB工艺结果

表13：模拟移动床SMB工艺方法（MO - 方法）

表 18 AZURA 模拟移动床系统配置

3. 结论

本研究开发了一套以乙醇为溶剂的模拟移动床色谱方法，用于从富含大麻二酚的大麻提取物中纯化大麻二酚。结果表明，使用高浓度样品可在保持纯度不变的前提下，将每个循环的产量从 42mg 提升至 95mg，回收率降低 10%。

• 半浓度样品（CBD 浓度 8.34mg/mL）：每小时纯化 36mg，每日 878mg
• 高浓度样品（CBD 浓度 20.54mg/mL）：每小时纯化 83mg，每日约 1997mg

提取物纯度从 77% 提升至 93%。本研究展示了模拟移动床技术从样品中纯化高纯度目标化合物的应用，该方法针对大麻二酚开发，可根据目标物适配其他样品中的目标化合物。

如您对AZURA®LAB SMB模拟移动床系统和应用感兴趣，可关注绿绵科技官方微信公众号，或致电联系我们，以获取更多的信息和支持。

长按识别二维码，关注绿绵科技公众号

TEl：010-82676061/2/3/4/5/6/7

E-mail:  marketing@lumtech.com.cn

全国服务电话：400-810-8267