你的细菌，真的死了吗？

2026-03-09 11:54:19, 赛默飞生命科学赛默飞世尔科技生命科学产品

在微生物研究中，判断细菌的存活状态几乎贯穿所有应用场景：从饮用水和食品安全评估，到抗菌材料测试、消毒工艺验证，再到感染控制与环境风险分析，实验最终都需要回答一个看似简单、却极其关键的问题——处理之后，细菌还剩下多少生物学活性？

长期以来，我们对细菌存活状态的判断，往往依赖一些看起来非常确定的指标：
能不能培养、是否具有代谢活性、膜是不是完整^[1]。

这些方法成熟、稳定、被广泛应用，但越来越多研究提醒我们：这些指标描述的，更多是结构状态，而不一定等同于生理结局。随着研究对象从“理想实验菌株”走向真实环境样本，人们逐渐意识到：细菌的生存状态远比“活或死”复杂。细菌在自然与宿主环境中普遍处于连续、多维的生理状态谱系。然而传统微生物学实验在很大程度上难以捕捉细菌在应激条件下的真实生理响应与行为变化。如果检测手段无法区分这些中间态细胞，就可能低估残留风险，或误判处理效果。

用于评估细菌存活与否的代表性方法

培养不到，并不一定意味着没有活性

通过将样本接种到适宜的培养基，观察是否形成菌落（Colony Forming Unit, CFU）被视为判断细菌存活状态的金标准，但细菌的不可培养状态（Viable But Non-Culturable, VBNC）带来了挑战。VBNC是细菌在不利环境压力下形成的一种可逆性生存策略，而非真正死亡，它在环境持留、疾病传播以及检测失败中具有重要意义^[2]。

2024 年发表在 Nature Communications 上的一项研究，给出了一个非常直观、也非常“刺眼”的例子：在水环境中，李斯特菌（Listeria）通过主动丢弃细胞壁进入VBNC状态^[3]。在这种状态下，细菌对环境压力具有更强耐受性，同时也逃逸了几乎所有常规的检测手段。这项研究真正值得警惕的地方在于：这些“看不见”的细菌，在合适条件下仍然可以恢复生长，甚至重新具备致病性。

采用非培养方法，如 LIVE/DEAD BacLight 细菌活力检测染色能直接通过显微观察来检测细胞是否具有完整的细胞质膜，从而判断其存活状态。SYTO BC 染料，是一种核酸染色剂，它可轻易渗透革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，在活细菌内产生异常明亮的绿色荧光信号；碘化丙啶核酸染料（PI）只能渗透受损的细胞膜，但凭借更高的亲和力，PI可以令已经死亡或即将死亡的细菌发出红色荧光。

利用特异识别cell-wall-deficient Listeria monocytogenes 的抗体与LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit (货号L7012) ，跟踪细胞壁状态同时监控细菌存活情况，证明李斯特菌在向VBNC状态转变的过程中逐渐丧失其细胞壁。

当“红”和“绿”不足以代表细菌命运

虽然BacLight 是优秀的生理检测手段，但SYTO/PI LIVE–DEAD BacLight报告的是核酸可及性与膜通透性，而非细菌代谢状态或长期命运。这一点在单细胞层面的成像研究中被进一步放大。

英国利物浦大学表面科学与抗菌材料团队发现，运用荧光显微镜和SYTO9/PI LIVE–DEAD 染色虽然能够对细菌群体存活情况做出概览，但SYTO9/PI 染色与细胞膜完整性并非一一对应，它无法真实反映单细胞生理状态^[4]。即使呈现相同的 SYTO9/PI 染色结果，细胞在膜结构、完整性以及内部组织状态上仍可能存在显著差异。必须寻找能够进一步细化分析细菌活性的高灵敏检测方法才能满足抗菌材料开发工作需求。

染色状态识别示意图。SYTO 9/PI共染可能获得四种不同状态的细菌染色结果，因此红/绿二元判断不足以在单细胞水平回答细菌是死还是活这一问题。

警惕细菌活性判定的灰色群体

发表于 Frontiers in Microbiology 的一项研究给了一个非常有代表性的示例^[5]。研究者在水处理模型中发现，经过 UV 或热处理后，虽然大量细菌已经无法培养，但其中一部分细胞仍然保留蛋白质合成能力。也就是说，它们在生理层面并未完全“关闭”。研究者并没有停留在培养或染色结果上，而是将代谢标记与流式细胞术结合【Attune NxT声波聚焦流式细胞仪（赛默飞世尔科技，美国）】，在单细胞层面区分出不同活性水平的细菌亚群。这种分辨能力，是单一培养法或显微判断很难实现的。因此，流式细胞术在细菌存活分析中的角色，正在发生变化，它不再只是一个“计数工具”，而是一个能够整合多种染料和功能性探针、对细菌活性进行多维解析的平台。

流式细胞分选技术原理示意图

当 LIVE/DEAD、代谢标记或功能性荧光探针被同时纳入分析时，流式细胞术提供的，不只是一个比例结果，而是一张关于细菌生理状态的精细分布图。对于希望更准确评估消毒效果、耐受性或潜在风险的相关研究来说，这类“细化后的存活分析”，往往比一个简单的“活/死结论”更有价值。

细菌存活性实验设计思路

Step 1｜用 LIVE/DEAD 快速建立群体轮廓

LIVE/DEAD BacLight 依然是快速、稳定、可靠的生理筛选工具。在越来越多研究中，它被用作：

1. 快速建立细胞群体轮廓

2. 结合流式多参数信息识别连续谱

3. 聚焦那些原本会被一刀切掉的中间态群体

Step 2｜用流式识别连续谱，而不是设死阈值

流式细胞术的独特价值在于它不急着给细菌下结论。

流式并不要求你先回答“它是活还是死”，而是允许你先看到一个事实：在同一处理条件下，细菌群体本身就是高度异质的。

在细菌存活性研究中，流式可以清楚地揭示：

1. 处在 PI 高、PI 低、或连续过渡区间的不同亚群

2. FSC/SSC 明显改变、但并未完全崩解的细胞

3. 染色信号与结构状态不再一一对应的“灰区群体”

4. Flow cytometry in microbiology

Step 3｜把“灰区”作为重点研究对象

这些细胞，正是最容易被培养法和传统染色法忽略，却最可能恢复活性的部分。

更重要的是，流式细胞术提供的并不是一张“好看”的结果图，而是一个可量化、可比较、可重复的单细胞分布图。这让研究者第一次有机会，把 VBNC 从一个“模糊概念”，转变为可以被系统研究的生理状态谱系。

当研究重心从“有没有长出来”转向

“在这一刻，群体中每一个细菌处在什么状态”

细菌存活性研究，才真正进入了一个新的阶段。

细菌存活性分析工具汇总

Q&A

FAQ 1｜SYTO 染料可以与其他核酸染料联用吗？适合哪些分析？

可以。SYTO 染料常与膜非通透型核酸染料（如 SYTOX 系列、PI）联用，用于区分活/死微生物、评估细胞膜完整性，或在多参数流式分析中实现微生物群体的精细分群。

FAQ 2｜含 SYTO 染料的即用型试剂盒有哪些？它们之间有什么区别？

赛默飞提供多款含 SYTO 染料的即用型微生物活性分析试剂盒（如 LIVE/DEAD™ BacLight™ 系列），可用于快速、标准化的细菌活/死分析。不同货号在试剂形式和应用侧重点上有所区别：

有奖互动——晒出你的独家tips

· 微生物分离培养、物种鉴定秘诀！

· 微生物活性分析如何避免假阳性、假阴性结果？

· 避免污染的第一要务！

快来把你的独家秘笈po到评论区，点赞最多的3位均可获得幻响s5充电宝一台。

注：互动截至2026/2/15；收件信息将于2月底收集，届时请关注来自“赛默飞生命科学”公众号的私信；礼品将在3月初陆续寄出。

参考文献（上下滑动查看更多）：

[1] Trinh KTL, Lee NY. Recent Methods for the Viability Assessment of Bacterial Pathogens: Advances, Challenges, and Future Perspectives. Pathogens. 2022 Sep 16;11(9):1057. doi: 10.3390/pathogens11091057. PMID: 36145489; PMCID: PMC9500772.

[2] Oliver JD. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev. 2010 Jul;34(4):415-25. doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x. Epub 2009 Nov 24. PMID: 20059548.

[3] Carvalho F, Carreaux A, Sartori-Rupp A, Tachon S, Gazi AD, Courtin P, Nicolas P, Dubois-Brissonnet F, Barbotin A, Desgranges E, Bertrand M, Gloux K, Schouler C, Carballido-López R, Chapot-Chartier MP, Milohanic E, Bierne H, Pagliuso A. Aquatic environment drives the emergence of cell wall-deficient dormant forms in Listeria. Nat Commun. 2024 Oct 2;15(1):8499. doi: 10.1038/s41467-024-52633-7. PMID: 39358320; PMCID: PMC11447242.

[4] Lindivat M, Bratbak G, Larsen A, Hess-Erga OK, Hoell IA. Flow Cytometric Analysis of Bacterial Protein Synthesis: Monitoring Vitality After Water Treatment. Front Microbiol. 2021 Dec 10;12:772651. doi: 10.3389/fmicb.2021.772651. PMID: 34956134; PMCID: PMC8702973.

[5] Luo J, Raval R. Correlative Imaging and super resolution microscopy studies reveal complexities in determining live-dead state of bacteria. Biofilm. 2025 Jul 3;10:100302. doi: 10.1016/j.bioflm.2025.100302. PMID: 40703962; PMCID: PMC12284284.