SCIEX Citrine系统助力华山检验在神经系统代谢与生物药监测领域取得新突破

色氨酸是人体必需氨基酸，在体内主要通过5-羟色胺（血清素）通路和犬尿氨酸通路代谢，生成血清素（5-HT）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、褪黑素以及犬尿氨酸类代谢物等。这些代谢物在情绪调节、神经递质平衡、神经炎症及神经退行性变中发挥重要作用，因此被广泛关注为潜在的神经系统疾病生物标志物。然而脑脊液采集具有侵入性、依从性较差，许多研究尝试使用血浆或血清指标作为中枢神经系统代谢的“替代指标”。然而，在临床研究实践中，一直尚未被充分验证的问题是：外周血浆中的色氨酸代谢物，是否能够反映中枢神经系统内的真实代谢状态？既往相关研究多存在以下局限：（1）样本量小，或依赖非人灵长类动物模型；（2）多数仅关注单一代谢物；（3）血浆与脑脊液并非同时采集；（4）并非在真实临床环境中收集样本，缺乏真实临床人群的数据支持。因此，系统评估血浆与脑脊液中色氨酸及其代谢物的相关性，并分析其在不同神经系统疾病中的表达特征，具有重要的临床与方法学意义。

近日，复旦大学附属华山医院检验医学科在 Clinica Chimica Acta杂志上发表了一项基于真实临床人群的系统研究“Plasma and cerebrospinal fluid correlation for tryptophan and its metabolites and their expression in neurodegenerative, demyelinating, infectious diseases and CNS tumors”。该研究基于大样本、同步采集的血浆–脑脊液配对样本，应用所建立的LC-MS/MS多指标定量检测方法，系统评估了色氨酸、血清素、5-羟基吲哚乙酸、褪黑素及犬尿喹啉酸在不同神经系统疾病中的表达特征和在外周和中枢系统间的相关性。研究结果表明，血浆中色氨酸代谢物水平难以准确反映其在脑脊液中的真实变化，而脑脊液在揭示中枢神经系统疾病，尤其是中枢神经系统肿瘤相关代谢改变方面具有更高的信息价值。本文第一作者为复旦大学附属华山医院检验医学科邓宇航博士，通讯作者为检验医学科关明教授及蒋浩琴教授，共同负责研究设计、数据解读与论文修订工作。

图1 色氨酸及其代谢物/同位素内标LC-MS/MS图谱

通过Pearson 相关分析，我们系统评估了血浆与脑脊液中对应指标之间的相关性，发现：（1）TRP、5-HT、褪黑素及 KYNA 在血浆与脑脊液之间虽具有统计学意义上的相关性，但相关系数整体较低（r = 0.15~0.30）；（2）5-HIAA 在血浆与脑脊液之间未观察到显著相关性。因此，在真实临床人群中，血浆中色氨酸代谢物水平难以准确反映其在中枢神经系统内的浓度变化。

图2 色氨酸及其代谢物脑脊液与血浆相关性分析图

在健康对照人群中，我们进一步分析了年龄和性别因素对血浆指标的影响，结果显示：（1）血浆 TRP 和 KYNA 水平在男性中高于女性；（2）血浆褪黑素水平随年龄增长呈下降趋势；（3）其余指标未观察到明显年龄相关变化

图3 年龄和性别对色氨酸及其代谢物的影响

（1）血浆层面：疾病间差异有限

本研究将患者分为神经退行性疾病、脱髓鞘疾病、中枢神经系统肿瘤及感染性疾病四大类后，我们发现：（1）血浆 TRP、KYNA、5-HT 在不同疾病组间无显著差异；（2）但 5-HIAA 在所有疾病组中均显著低于健康对照。这一结果提示，血浆 5-HIAA 的下降可能反映一种非特异性的疾病相关改变。

图4 血浆中色氨酸及其代谢物在疾病组间以及疾病组与正常对照组件对比

（2）脑脊液层面：肿瘤相关代谢特征更为突出

相比之下，脑脊液分析显示出更清晰的疾病特异性特征：中枢神经系统肿瘤患者CSF 色氨酸和KYNA明显高于其他疾病组。这一发现与既往关于肿瘤中色氨酸代谢异常、犬尿氨酸通路激活的研究结果在生物学层面具有一定一致性，但本研究强调：这些改变主要体现在脑脊液中，而非血浆中。

图5 脑脊液中色氨酸及其代谢物在各疾病组间的表达差异

AD是全球最重要的神经退行性疾病之一，近年来，靶向 β-淀粉样蛋白的单克隆抗体药物成为治疗研究热点。Donanemab 作为最新获批进入临床应用的抗 AD 人源化 IgG1 单抗，准确测定其血清浓度对于：（1）药代动力学研究；（2）给药方案优化；（3）疗效与不良反应评估；均具有重要意义。目前，临床研究中主要依赖ELISA等免疫学方法检测此类抗体，但该类方法普遍存在：（1）交叉反应风险高；（2）特异性和可比性不足；（3）不同实验室结果难以统一。因此，开发一种高特异性、可溯源、可标准化的新型检测方法尤为重要。

本研究首次报道了一种基于免疫捕获多奈LC-MS/MS检测方法，主要技术特点包括：

1、免疫亲和富集 + 质谱检测的创新组合

（1）采用 Protein G 磁珠对血清中Donanemab 进行捕获与富集

（2）有效去除内源性免疫球蛋白干扰

（3）在保证特异性的同时，成本可控、操作稳定

2、 胰酶消化 + 特征肽段定量

（1）对富集后的抗体进行快速胰酶消化

（2）选择Donanemab特异性signature peptide进行靶向LC-MS/MS定量

（3）以西妥昔单抗（Cetuximab）作为全流程内标，确保定量准确性

该方法性能验证结果显示：定量下限（LLOQ）：0.1 μg/mL; 线性范围宽：0.2–200 μg/mL; 精密度良好：总 CV < 8%; 准确度高：回收率 95–100%; 人/鼠血清中性能一致，适用性强，整体性能不低于甚至优于现有 ELISA 方法，同时具有更高的特异性和方法学可比性。

表1 所建LC-MS/MS方法加标回收率及精密的验证结果

为验证该方法的实际应用价值，研究团队进一步在小鼠模型中开展了Donanemab的初步药代动力学研究：（1）通过静脉注射Donanemab后在多个时间点采集小鼠血清样本，成功获得清晰、合理的药时浓度变化趋势，计算并分析了关键 PK 行为特征。结果充分证明：该LC-MS/MS方法可稳定、可靠地用于单抗药物体内动态监测和 PK 研究。

图2 小鼠药代动力学研究

（1）首次建立Donanemab的 LC-MS/MS 定量方法

（2）突破传统ELISA在特异性和可比性方面的局限

（3）免疫捕获 + 质谱检测，兼顾特异性与经济性

（4）同时适用于临床样本和动物模型

（5）为AD单抗药物的精准监测和机制研究提供新工具

该研究为阿尔茨海默病单克隆抗体药物的定量检测提供了全新的技术路径，也为未来抗体药物的临床监测和转化研究奠定了坚实基础。