请注意查收｜微载体MSC细胞培养手册

2026-01-21 14:41:35, Zhao Shouyuan Cytiva（思拓凡)

MSC细胞

自1995年，Lazarus等在Bone Marrow Transplant上首次报道了MSC临床研究以来，MSC由于具备易获得、多项分化潜能、良好的增殖率和临床应用的安全性等特点，已经在临床上被广泛应用于多种疾病的治疗性研究。

目前，有关MSC的治疗方法已经研究了数十年，相关的许多临床研究已经完成或正在进行中，截止2021年4月，在http://ClinicalTrials.gov网站检索到的间充质干细胞临床试验超过1200个，其中从2015年到2021年间注册的MSC临床试验就有416项。大多临床试验集中在：肌肉/骨及软骨疾病、外伤及损伤治疗、新冠治疗、脑神经疾病和心脏及心血管疾病等领域。^［1］

图1：MSC临床试验分布

MSC细胞培养方式

截至目前，MSC的培养放大依然更依赖于传统的2D贴壁培养，比如T型方瓶、滚瓶或多层细胞工厂等，但这些方法在培养过程中容易受到污染，而且往往空间占用大且劳动密集，也越来越无法满足临床更大的需求量，所以结合WAVE波浪式反应器或者XDR反应器的大规模3D微载体悬浮培养MSC细胞正在成为现在的主流方向。

图2：MSC细胞的培养方式

Cytiva微载体助力大规模MSC细胞培养

使用Cytiva微载体大规模培养干细胞的工艺流程如下图，主要包括微载体的前期准备（包括水合、灭菌、平衡）以及干细胞在2D贴壁培养中的复苏和扩增，然后把足量的MSC细胞接入装有微载体的WAVE或者XDR反应容器中进行培养，在MSC细胞进行持续扩增之后，根据项目的不同回收细胞或者收取上清。（具体case可参考往期微文：☛ 客户案例分享| 如何高效无血清培养间充质干细胞 (MSC) ）

图3：3D微载体大规模培养干细胞的工艺流程

针对目前MSC细胞项目的不同，Cytiva可以提供多种微载体助力MSC细胞的大规模培养。基质为葡聚糖的Cytodex 1&3微载体，以及基质是纤维素的Cytopore 1&2微载体都很好地满足了MSC对微载体系统的特殊需求。

Cytodex：表面特征经过优化，适于细胞高效粘附和伸展；大小和密度经过优化，有利于均匀悬浮，适于宽范围的细胞优良生长和高产；基质是生物惰性的，为搅拌培养提供了一个坚硬但是非刚性的底物；透明，贴附的细胞用简单的显微镜就能观察到；Cytodex的广泛应用证明了它在微载体培养技术中的重要性和价值。

Cytopore：Cytopore是一种大孔微载体，保护了细胞不受剪切力的损伤，允许细胞创建一个微环境优化的表面特征适合于细胞的有效粘附和伸展；优化的大小、密度和大孔性以促进均一悬浮/流化，并使各种细胞优良地生长和高产生物惰性的基质为搅拌微载体培养提供了一个坚固的非刚性底层。

图4：Cytiva微载体参数

除标准的Cytodex产品外，Cytodex还有经过Gamma射线灭菌的产品，无需繁琐的水化灭菌，可以直接使用。Cytodex Gamma微载体使用无菌的PET瓶包装，干燥无菌的Cytodex Gamma产品可节省存储空间且方便运输，包装的容器配备了灵活的无菌接头，通过无菌接头连接可方便转移到各种细胞培养容器中，可以省去大量的微载体准备和灭菌时间，微载体可直接加入生物反应器中，可快速启动培养。

图5：Cytodex与Cytodex Gamma的使用对比

Cytiva微载体培养MSC细胞的Tips

如何实现细胞与微载体的分离？

Cytiva微载体密度略大于水，且沉降系数在12-19 cm/min，在消化后可通过自然沉降的方法让微载体先沉降，抽取上清从而回收细胞；此外，微载体溶胀之后直径大约150-230 μm，而细胞直径大约10-20 μm，故也可以定制70-100 μm的不锈钢筛网截留微载体回收细胞。

如何进行微载体细胞培养工艺放大？

根据最终生产规模而定，可以从多层细胞工厂扩增培养足够量的细胞经消化后直接接入含有微载体的N代反应容器内进行MSC细胞培养；也可以通过不同规模的微载体球转球工艺进行放大，其中球转球工艺涉及到原位消化和非原位消化以及是否保留旧微载体，针对不同项目的不同情况Cytiva可提供不同的技术方案。

MSC细胞贴不上微载体可能的因素有哪些，可以采取什么措施？

不同来源的MSC表达特定粘附分子的不同，那么微载体、表面涂层的选择以及相关工艺参数对于要扩增的不同类型的MSC细胞也至关重要。从微载体选择上来讲，对于大部分的贴壁细胞Cytodex 1都能满足其贴附生长，对于部分贴附效果不好的MSC细胞可以考虑Cytodex 3，Cytodex 3表面有一层变性胶原，更有利于细胞贴附。

从培养工艺来讲，对不好贴附的细胞，在细胞接种的D0-D1尤为重要，推荐初始培养体积可以是最终培养体积的1/3-1/2，从而提高细胞与微载体的接触概率；此外，搅拌转速的设置也很重要，可以采取接种后静置过夜培养或者间歇式搅拌来提高细胞贴附。

如何选择合适的微载体类型？

一个是依据细胞是否容易贴上微载体，参考Q4；另外就是依据项目类型，对于需要回收细胞的项目推荐实心微载体Cytodex 1&3，对于分泌型产品推荐大孔微载体Cytopore1& 2，能够提供更高的表面积供细胞生长。

细胞消化过程中需要注意什么？

含血清工艺在加入胰酶前，先用不含钙离子和镁离子的PBS至少清洗2次以上，直至FBS含量小于1%；选择合适的胰酶与浓度，以及合适的胰酶用量，消化过程中维持温度和搅拌，加速细胞的微载体的分离。

微载体的使用量推荐？

常规投料量3-5 g/L，灌流工艺微载体投料量可以达到10-20 g/L。

微载体可以重复使用吗?

不推荐多次使用微载体。重复使用用于细胞培养的表面，需要强酸或强碱溶液来洗涤。这些步骤要求去除收获步骤之后残留的细胞碎片。对于Cytodex 1，不推荐使用这些过程，因为极强端的pH将改变微载体基质的性质和取代程度。用过的微载体可以在收获步骤后用无菌的PBS直接洗涤，然后用于下一级培养，但是对细胞的粘附力较弱而且产量不到新微载体得到的产量的70%。对于所有测试的细胞类型而言，重复使用微载体三次都是不可行的。对于一些细胞株来说，基本上是不能重复使用微载体的。用酶法收获细胞时，Cytodex 3微载体不能够被重复使用。大规模生产中，重复使用微载体的清洗过程的成本比使用新微载体的成本还高。

小结

综上所述，Cytiva微载体可以提供市面Top表面积、且微球更均一细胞更好贴附、以及非常成熟的球转球放大工艺和技术支持。截止目前Cytiva微载体已大量应用于疫苗工业中，相信未来也必将助力MSC细胞大规模培养更上一层楼。

Cytiva微载体订货信息如下

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参考文献：

[1] Galderisi U , Peluso G , Bernardo G D .Clinical Trials Based on Mesenchymal Stromal Cells are Exponentially Increasing: Where are We in Recent Years?[J].Stem cell reviews and reports, 2022(1):18.DOI:10.1007/s12015-021-10231-w.

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