膜蛋白合集 | MST和SpS结合Nanodisc甜甜圈“让您的膜蛋白互作被看见”

2025-11-27 10:26:36, 丁浩诺坦普科技（北京）有限公司

关键词: 膜蛋白|去垢剂|Nanodisc纳米盘|MST微量热泳动|SpS光谱位移

膜蛋白--生命活动的“守门员”

在每个细胞的边界，都有一群默默无闻的“守门员”——膜蛋白。它们镶嵌在细胞膜上，控制着物质进出、信息传递和能量转换，是生命活动不可或缺的核心角色。据统计，膜蛋白占细胞膜总质量的40%-50%，并且是超过60%现代药物的作用靶点。然而，这位重要的“守门员”却异常“孤僻”，给科研工作带来了巨大的挑战，成为最难捕捉的研究对象之一。

工欲善其事，必先利其器

要研究膜蛋白，首先要获得稳定且有活性的蛋白样品。目前主流的制备平台主要有：

去垢剂（Detergent）平台

经典而高效

这是最经典的方法。去垢剂分子像“小胶囊”（胶束）一样，包裹住膜蛋白的疏水区域，模拟其在细胞膜中的环境，从而将其从膜上溶解下来。这种方法成本相对较低，技术成熟，适用于多种下游应用。

纯化基本原理：去垢剂（detergent）是一类两亲性分子，能够插入细胞膜的脂质双层并破坏膜结构，从而将膜蛋白从细胞膜上溶解下来。去垢剂的疏水部分与膜蛋白的跨膜疏水区域结合，亲水部分朝向水相，形成可溶性的去垢剂-蛋白复合物胶束。通过选择合适的去垢剂和条件，可以使膜蛋白在脱离细胞膜后仍保持天然构象和功能。这一方法利用去垢剂胶束模拟脂质环境，使原本不溶的膜蛋白溶解于水相，从而进行后续的纯化和研究。

Nanodisc 技术平台

更接近天然的“微型细胞膜”

Nanodisc（纳米盘）技术提供了一个更接近天然的解决方案。它由一个“甜甜圈”状的膜支架蛋白（MSP）环绕一小片磷脂双分子层构成。膜蛋白可以插入到这片微型细胞膜中，从而在更稳定的近天然环境中进行研究。

纯化基本原理：Nanodisc（纳米圆盘）是一种人工构建的盘状脂质双分子层纳米颗粒，能够将膜蛋白嵌入其中，形成稳定的水溶性复合物。其基本结构是在脂质双层的周边由特定的支架蛋白（通常是膜支架蛋白MSP，来源于载脂蛋白A-I的片段）环绕稳定。当目标膜蛋白与合适的磷脂、MSP混合并去除去垢剂时，三者会自组装形成膜蛋白-Nanodisc复合物：膜蛋白嵌入圆盘中央的脂双层中，周围由MSP形成的“腰带”固定。这样一来，膜蛋白处于接近天然的脂质环境中，同时整个复合物因MSP的两亲性而可溶解于水相。Nanodisc技术提供了一个无去垢剂的膜蛋白稳定平台，使膜蛋白在体外保持天然构象和功能成为可能。

让“看不见”的相互作用“被看见”

Monolith在功能研究中的应用

获得了稳定的膜蛋白只是第一步，更关键的是研究其功能——即它如何与其他分子（如药物、激素、病毒等）相互作用。光谱位移（Spectral Shift, SpS）技术及微量热泳动（MST）技术，作为Monolith和Dianthus系列仪器的核心技术，为膜蛋白的亲和力研究提供了强大而精准的工具，具有样品消耗量极低、无需固定、溶液中进行、测量范围广等优点，尤其适合“娇气”的膜蛋白，下面分享多种方式进行亲和力检测的案例。

案例1

传统去垢剂纯化进行光谱位移实验

研究对象：G蛋白偶联受体（GPCR）A2AR

应用场景：筛选新型胆固醇衍生物作为蛋白稳剂和基于片段的药物筛选

解决方案: 研究人员使用光谱位移技术，快速评估了在不同稳定(DDM:CHS, DDM:Chol-DG等)条件下，A2AR与其配体的结合亲和力，验证了新型稳定剂的可行性。在另一项研究中，利用光谱位移技术对826个小分子片段进行筛选，高效地发现了20个对A2AR有拮抗活性的先导化合物，极大地加速了新药研发进程。

使用耗材: 二代RED-tris-NTA标记试剂盒（MO-L018）/普通型毛细管（MO-K022）

使用光谱位移技术开发筛选实验

案例2

SMA等合成共聚物与光谱位移技术联用

研究对象：离子通道P2X4、GPCR GLP1R、病毒受体NTCP

挑战：在最接近天然的环境中，研究膜蛋白与小分子、多肽和蛋白的相互作用

· P2X4（离子通道）与小分子（5-BDBD）结合：测得K_d为4.29 µM

· GLP1R（GPCR）与多肽拮抗剂（Exendin）结合：测得K_d为4.51 nM

· NTCP（病毒受体）与乙肝病毒表面抗原（LHBsAg）结合：测得K_d为967 nM

这些结果覆盖了从小分子到大蛋白的各类互作，充分展示了将先进的蛋白制备技术与高灵敏度的检测技术相结合，使用Nanodisc包裹膜蛋白，还原最贴近天然环境的互作情况。

使用耗材: 二代NHS赖氨酸标记试剂盒（MO-L011）/普通型毛细管（MO-K022）

案例3

融合GFP无需标记进行MST实验

研究对象：植物硝酸根转运蛋白NRT1.1与硝酸根离子的结合

挑战：膜蛋白本身不稳定；硝酸根是分子量极小（62 Da）的离子；亲和力非常弱（mM级别）

解决方案: 将GFP融合到NRT1.1蛋白末端，纯化后无需进行标记可直接进行MST实验，避免固定或标记对蛋白的影响。通过MST技术，成功测定了野生型NRT1.1与硝酸根的结合（K_d=1.3 mM），并验证了关键位点突变（H356A）后结合能力的丧失。这证明了MST技术对小分子和弱亲和力相互作用的强大检测能力。

使用耗材:无需标记试剂盒/普通型毛细管（MO-K022）

MST精准测量了NRT1.1与硝酸根的弱亲和力结合

案例4

MSP纯化膜蛋白进行MST实验

研究对象：细菌分裂马达蛋白TolR与TolA互作实验

挑战：不使用去垢剂进行纯化的样品，保持膜蛋白天然构象状态

解决方案: 先标记纯化好的MSP蛋白，再通过使用带荧光标记的MSP包裹目的膜蛋白，避免了对膜蛋白的的标记和固定，最后通过His标签纯化后进行MST检测，既保留了膜蛋白的原始状态，又保留了化学荧光基团的高灵敏度。

使用耗材: 市售AF647标记试剂盒（A647, Life Technologies）/优化型毛细管（MO-K025）

荧光标记MSP后包裹膜蛋白

MST检测CXCL12与HMGB1的亲和力

案例5

Label Free基于蛋白内源荧光进行MST实验

研究对象：生长素转运蛋白AUX1与IAA的亲和力分析

挑战：仅进行蛋白纯化后直接进行互作实验，避免固定和荧光标记，不遮蔽膜蛋白任何表面

解决方案: Label Free型号Monolith分子互作平台可检测蛋白质的内源荧光，从而进行膜蛋白和小分子的互作实验，高效便捷的实验流程给膜蛋白最宽容的实验条件。

使用耗材: 无需标记/优化型Label Free毛细管（MO-Z025）

MST检测AUX1和IAA的亲和力

技术细节：如何给膜蛋白“打上标记”？

为了使用光谱位移及微量热泳动等荧光技术追踪膜蛋白，我们通常需要给它“打上”一个荧光标记。这就像给蛋白穿上一件会发光的衣服，方便我们观察它的行踪，常用的标记方法有：

· 亲和标记：在蛋白上预先设计一个“小尾巴”（如His-tag、Strep-tag），然后使用与这个“小尾巴”特异性结合的荧光染料进行标记。这种方法可实现定向标记，操作便捷，如案例一分享的实验。

· 共价标记：利用化学反应，将荧光染料分子直接“粘”在蛋白表面的特定氨基酸上，如赖氨酸（Lys）或半胱氨酸（Cys）。这种方法可以实现稳定的标记，如案例二分享的实验。

· 基因融合标记：通过构建载体，将绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白的基因与目标膜蛋白的基因连接在一起，通过GFP荧光直接检测，如案例三分享的实验。

· 标记Nanodisc：通过亲和标记或者共价标记的方式对Nanodisc包裹的膜蛋白进行荧光标记。这种方式可以完全不影响膜蛋白本身的构象和活性位点。如案例四分享的实验。

· 免标记：利用膜蛋白的内源荧光，直接检测膜蛋白与小分子的互作，无需固定无需标记。如案例五分享的实验。

因此，选择合适的标记策略，对于获得高质量的分子相互作用数据至关重要。

NanoTemper技术优势

从经典的去垢剂到前沿的Nanodisc，从灵活的荧光标记到无需标记的内源荧光检测…Monolith系列分子互作检测平台以其极高的灵活性、灵敏度和宽容度，为攻克膜蛋白互作难题提供了一套“全流程”的解决方案。这不仅是技术上的突破，更为新药研发和生命科学探索打开了一扇全新的大门。

价格咨询

样品需求极低：只需10‑100 nM的标记膜蛋白，体积通常在200 µL以内，适合难以大量表达或纯化的膜蛋白。

对缓冲体系宽容：可在含去垢剂（DDM、OG、LMNG）、nanodisc（MSP）、SMA/DIBMA 聚合物等多种膜模拟体系中直接测定，无需更换缓冲或去除去垢剂。

不受分子大小限制：既能测定小分子‑膜蛋白，也能测定大分子‑膜蛋白（如蛋白‑蛋白、蛋白‑肽）相互作用，范围广

无需固定：只需在一个样品中加入荧光标记（MSP、His‑标签、GFP或使用免标记），不需要将膜蛋白固定在芯片或柱子上，避免因固定导致的构象改变

可在接近原生膜环境下测定：通过nanodisc、SMALP、lipid‑nanoparticle等体系，膜蛋白保持原生的脂质包埋状态，测得的亲和常数更具生理意义

兼容复杂体系：可在含辅因子、金属离子、pH/盐浓度梯度的条件下直接测定，便于研究膜蛋白在不同生理环境下的相互作用

参考文献

1.Porkolab V, Sigoillot M, Moreno A, Kanonenberg K, Corvest V, Brock C, Sage C, Legros C, Mirguet O, Ratcliffe P. Unprecedented Fragment‑Based Discovery Using Spectral Shift to Design Novel GPCR Ligands[EB/OL]. France: Eurofins DiscoverX, 2024.

2.Hanisch PT, Esser LM, Balanda S, Sabharwal N, Fis A, Zhang P. Application Note: Achieve Highly Sensitive and Precise Binding Affinity Measurements Without Disrupting Protein Conformation[EB/OL]. Munich: NanoTemper Technologies GmbH, 2025.

3.Parker JL, Newstead S. Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1[J]. Nature, 2014, 507(7490): 68‑72. DOI: 10.1038/nature13116

4.Patricia M. Dijkman, Anthony Watts,Lipid modulation of early G protein-coupled receptor signalling events,Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2015.08.004

5. Yang Z, Wei H, Gan Y, et al. Structural insights into auxin influx mediated by the Arabidopsis AUX1[J]. Cell, 2025, 187(5): 00463‑5. DOI: 10.1016/j.cell.2025.04.028