有“熔”乃大：熔解曲线开启多重检测新方法

传统观点认为SYBR Green染料法实验只适合做单重靶标的检测，因为SYBR Green染料与双链DNA结合时，没有序列识别的特异性。但是通过实验优化之后，熔解曲线也可以进行多重检测。如2025年BMC Veterinary Research杂志报道了一种基于SYBR Green I染料的三重实验，成功实现了对猪的三种病毒（伪狂犬病毒，简称PRV；猪细小病毒，简称PPV；猪圆环病毒3型，简称PCV3）的同时检测^[1]。首先作者整理了这三种病毒在全球多地上报的序列信息，通过Clustal W 软件确定它们的高保守区域，并在此区域设计上下游引物（图1 A）。随后在实验优化过程中，作者分别对引物浓度，扩增试剂及PCR反应程序进行了摸索，在确保扩增效率接近100%的基础上，发现这三种病毒在熔解曲线阶段表现出差异明显的峰型及Tm值（PRV为90℃，PPV为84℃，PCV为80℃），以此实现了在一次实验中同时对这三种病毒的有效区分（图1 B-D）。

图1 针对PRV，PPV，PCV3病毒设计检测引物及熔解曲线结果展示

紧接着作者将PRV、PPV 和 PCV3三种病毒的合成阳性质粒模板混合，对检出限进行测定。结果显示，新开发的方法检出限为1.87×10² copies/μL（图2D-E）,相较只能进行单重检测的传统 PCR 法而言具有更强的灵敏度（对PRV， PPV， PCV3的检出限分别为4.67×10² copies/μL，3.67×10² copies/μL，3.07×10² copies/μL，图2A-C）。

图2 SYBR Green染料法多重qPCR 检测限分析（A-C：使用梯度稀释的阳性质粒模板pMD-PRV , pMD-PPV , pMD-PCV3进行传统PCR法检出限的测定，模板浓度分别为 4.67×10⁶ -4.67 × 10⁰，3.67 × 10⁶- 3.67 × 10⁰ copies/μL，3.07 × 10⁶-3.07 × 10⁰ copies/μL；D-E：将pMD-PRV , pMD-PPV , pMD-PCV3进行混合，进行三重实验检出限的测定，模板浓度为1.87 × 10⁷-1.87 × 10 copies/μL）

最后，作者还对来源于9个地区养殖场的81份样本进行了检测，证明该方法的结果与传统方法高度一致，说明SYBR Green染料法实验结合熔解曲线分析进行多重靶标检测的可行性。

高分辨率熔解曲线分析法（High Resolution Melting, HRM）在2003年被首次提出^[2]，与传统的SYBR Green染料法不同，它在 PCR 反应体系中加入高浓度的饱和荧光染料，如LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等，且不抑制PCR扩增；当双链DNA局部解链时，游离下来的染料亦不会重新结合到DNA分子上，所以荧光强度的降低可精准反映DNA分子的解链情况（图3）^[3]，从而使得熔解曲线具有更高的分辨率。HRM因其操作简便、快速、高通量等优势，逐渐受到关注并被广泛应用于突变检测、基因分型、甲基化分析等多个领域。

图3 传统非高饱和染料与HRM实验中的高饱和染料的区别

除了在这些领域的应用外，HRM方法同样可以用来做多重检测实验，比如2023年Scientific Reports杂志报道了一种基于HRM的新型多重实时荧光定量 PCR方法，可用于同时检测并区分牛、山羊和绵羊中的四种人畜共患流产性病原体（布鲁氏菌（Brucella spp.）、贝纳柯克斯体（Coxiella burnetii）、钩端螺旋体（Leptospira spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes））^[4]。在该实验中，作者首先针对这四种病原体设计特异性引物，保证每个扩增子在长度及GC含量上具有一定的差异，随后利用uMelt软件对扩增子的熔解曲线峰型及Tm值进行预测，查看它们是否表现出清晰的分离峰和差异显著的Tm值。

紧接着，作者又分别进行了针对这四种病原体的单重和四重实验优化，筛选出最佳的引物浓度和PCR反应程序，并排除了引物二聚体及非特异性扩增的问题，确认了该方法能够在一次实验中同时对四种病原体进行有效的区分（图4）。

图4 HRM方法进行人畜共患流产性病原体多重检结果展示（A. 四种病原体具有不同熔解曲线峰型和Tm值； B. 216份样本检测结果进行One-way ANOVA test显示四种病原体两两相比，平均 Tm 值差异极显著（p ≤ 0.0001）；C&D. 四种病原体进行HRM多重分析结果差异明显。）

此外作者还对该检测方法的检测灵敏性，特异性及重复性进行了评估，均展现出良好的结果，证明该方法可以作为一种用于检测反刍动物人畜共患流产性病原体单一感染和混合感染的有效工具。

熔解曲线步骤赋予了染料法实验多重检测的能力，那么探针法和熔解曲线又能碰撞出怎样的火花呢？2022年PNAS杂志报道了MeltArray 的新型多重荧光 PCR 技术^[5]。该技术利用 Taq DNA 聚合酶的 5''-flap 外切酶活性，将特异性的“mediator探针”切割成“mediator引物”，这些引物在 PCR 过程中作为识别码。通过分子信标探针，每个探针可以结合多个mediator引物，生成具有不同熔解温度的荧光双链 DNA，从而实现每个靶标由独特的荧光颜色和 Tm 组合识别，达到在单个反应中同时检测多达62个靶标的能力（图5）。

图5 MeltArray 的新型多重荧光 PCR 技术示意图

科研人员通过该技术进行了 20-重 PCR 检测人类 Y 染色体微缺失、62-重 PCR 鉴定大肠杆菌血清型（图6）、24-重 PCR 同时鉴定和定量呼吸道病原体等。所有实验均通过临床样本验证，显示出良好的灵敏度、特异性和准确性。

图6 62-重 PCR 鉴定大肠杆菌血清型（A：6种荧光标记探针通过熔解曲线Tm值不同同时区分61个O-抗原生物合成基因和1个大肠杆菌的特异基因yccT；B：多次实验显示该方法具有良好的Tm值重复性；C：MeltArray法，传统血清学及GWAS法对167个样本判定结果比较：通过常规血清学分析，共检测167株大肠杆菌，其中有150株具有33种不同的血清型，17株分型失败。150株中1个样本的MeltArray结果与血清学不符，但与WGS相符。17个分型失败菌株中有11个被MeltArray检测出来，且与WGS相符。剩下6个没有信号。WGS结果显示，其中4个的分型与MeltArray鉴定结果不一致，另外2个没鉴定出来。）

MeltArray 技术通过将荧光颜色和 Tm 结合作为二维标签，提高了实时 PCR 检测的多重能力，突破了传统qPCR 在多重检测方面的局限性，这项技术在临床诊断、病原体检测、遗传变异分析等领域具有广阔的应用前景。

通过以上三部分内容的介绍，我们可以看到熔解曲线分析在多重检测方面展现出了巨大的潜力，不管是传统的染料法还是探针法，因为叠加了熔解曲线实验，给多重检测提供了更多的可能性，随着技术的日臻成熟，熔解曲线分析正走出实验室，在分子诊断领域发挥更加重要的作用。

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图7 Quantstudio系列qPCR仪

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