四小名助 | 带您了解母乳中氨基酸的检测

2018-11-10 12:32:22 赛默飞色谱与质谱分析

又到周五啦！四小名助如约而至，给大家带来色谱耗材相关的实用技术小贴士。内容涉及色谱柱及前处理产品选择、使用、维护保养等内容。实用干货，不容错过！

赛默飞应用工程师

李兵

新课堂-Classroom

母乳是婴儿成长过程中重要的食品，国内外的孕婴保健机构都建议初生婴儿采用母乳喂养。母乳中含有的营养成分，如蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等，易于婴儿吸收。另外其所含有的抗感染因子，如IgA、乳铁蛋白、溶菌酶及各种细胞成分，可增强婴儿的免疫能力。因此，母乳中营养成分研究也成为营养学的一大领域。目前，已有对母乳中的维生素进行研究并加以报道，但少有氨基酸的研究报道。本研究采用酸性条件下水解母乳中蛋白质，柱前在线衍生与液相色谱紫外联用分析母乳中氨基酸。

样品前处理

试剂：甲醇、乙腈、水、三乙胺、四氢呋喃、乙酸钠、硼酸钠、氢氧化钠、乙醚、邻苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯、3-巯基丙酸、硫代乙醇酸、苯酚、三氟乙酸、盐酸

17种氨基酸混标溶液（除胱氨酸浓度为1.25μmol/ml，其它氨基酸浓度为2.5μmol/ml）

7M盐酸：量取558ml盐酸，用水稀释至1000ml量瓶中，摇匀。

水解催化剂：称取1g苯酚置100ml量瓶中，加入7M盐酸50ml使溶解，再加入10ml三氟乙酸和20ml硫代乙醇酸，用7M盐酸定容至刻度，摇匀，密封低温（4°C）保存。

样品由第三方医疗机构收集不同哺乳期妇女的乳液样品。样品呈乳白色悬浊液（含有少量黄色液体油脂。低温保存时，样品取出后放置在40°C水浴中使固体油脂融化）。

脱脂：量取1ml乳液样品置于离心管中，加入乙醚1ml，反复振摇3分钟，静置5分钟，在5000转/分条件下离心5分钟，弃去上层乙醚液。取下层溶液进行水解。

水解：吸取1ml脱脂后的母乳样品转移至真空水解管中，加入0.6ml水解催化剂，在0.05MPa压力下充氮保护3分钟，再减压脱气3分钟，密塞水解管并置于沸水浴上恒温加热8小时，冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调节pH值2-3范围内，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至10ml，摇匀并用微孔（0.22μm）滤膜过滤用于液相分析。

衍生程序

采用邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在碱性条件下分别与一级氨基酸和二级氨基酸发生反应，生成具有强烈紫外吸收的化合物。衍生过程在自动进样器中进行。

衍生试剂：

硼酸缓冲液： 200mM 四硼酸钠溶液（pH=10.2）

邻苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸缓冲液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巯基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀释液：流动相A

衍生过程：200mM 硼酸缓冲液（5μL）+样品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀释液（8μL）

仪器条件

仪器型号：

UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD， SN:8037084

变色龙®色谱管理软件（Chromeloeon®6.8 SR11）

色谱条件：

色谱柱： Hypersil GOLD C18色谱柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

流动相：A: 20mM 乙酸钠（加0.018%三乙胺，调节pH值至7.2，再加入0.3%四氢呋喃），B：100mM乙酸钠（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

梯度洗脱程序

进样量： 1μL

检测器：检测波长：380nm, 262nm, 3D扫描：190-400nm，采集频率：5Hz

流速： 1000μL/min

柱温： 35°C

实验数据

水解条件优化

在水解过程中，加热温度、水解持续时间和催化剂用量对水解有着重大影响。结合实际情况采用沸水浴加热进行水解，因此利用响应面法对水解时间和催化剂用量的影响进行了研究，结果见表1和图1。

表1 水解研究方案

图1 氨基酸水解优化结果

从图1中可以看出，水解时间延长对氨基酸增加效果不明显，水解催化剂用量对水解效率有显著影响，随着用量增大，氨基酸含量明显增加，且达到最大值，再增加用量时，氨基酸含量开始降低，可能原因是水解后的氨基酸在强酸性环境与高温加热条件下中发生降解从而引起含量降低。综合实际操作考虑，故用0.6ml水解催化剂在沸水浴中水解8小时可获得最佳水解氨基酸含量。

方法专属性

取0.1N盐酸做为空白试剂考察方法专属性，结果见图2和3。