使用ionKey/离子淌度质谱筛查和分析食品中的天然甜味剂甜菊糖苷

2019-02-20 09:24:22, Waters 沃特世科技（上海）有限公司

甜菊是一种原产于南美洲的菊科常青灌木。食品添加剂联合专家委员会(JECFA)建立了一系列关于甜菊糖苷的规定，要求七种化学定义的甜菊糖苷必须达到95%以上的纯度。对食品中的甜菊糖苷进行全面的残留分析是一项颇为棘手的任务，我们可采用一种具有高选择性和高灵敏度的初步筛选方法进行定性分析。

本应用纪要介绍了碰撞截面(CCS)测量与其它MS新技术联用能够为复杂混合物分析带来的选择性优势。研究结合了高分辨率质谱与基于离子淌度的高效测量和分离方法。本文介绍了一种采用ionKey™/MS和离子淌度质谱(IM-MS)筛查食品中的甜菊糖苷的独特方法，该方法利用了这两项技术明显展现了特异性和灵敏度的优势。目标甜菊醇和甜菊糖苷的结构如下图所示。

本研究中使用的甜菊醇和甜菊糖苷的结构

1、实验

LC条件

LC系统：ACQUITY UPLC^® M-Class

色谱柱：具有柱后添加功能的 iKey分离装置，BEH C18, 130Å, 1.7 μm, 150 μm x 50 mm

MS条件

MS系统：SYNAPT^® G2-Si

2、结果与讨论

本实验成功建立了在复杂混合物中筛查甜菊糖苷的高灵敏度和选择性的分析方法。

通过基于氮气的行波碰撞截面(^TWCCSN₂)、精确质量数、碎片离子和保留时间这些信息，鉴别甜菊糖苷莱苞迪甙A～F、甜茶苷、甜菊醇、杜克甙A、甜菊双糖苷和甜菊苷。使用标志物标准品轻松测得CCS测量值之后，我们将这些信息与预期的甜菊糖苷^TWCCSN₂值相结合，在UNIFI中创建了一个科学数据库。由于需要明确鉴定三对异构体，本次分析的难度进一步增大。甜菊糖苷极易碎裂，而且很可能发生源内碎裂，这会导致同分异构碎片产生，出现假阳性鉴定结果。将分析物加标至巧克力酱提取物，并使用ionKey/MS和离子淌度进行分析，然后与UNIFI^®中的甜菊苷^TWCCSN₂数据库进行比对筛查。

如下表所示，我们使用甜菊苷标准品确定了甜菊糖苷异构体对(甜茶苷241.31 Å/甜菊双糖苷235.78 Å)、(莱苞迪甙B 261.19 Å2/甜菊苷269.64 Å2)和(莱苞迪甙A 298.9 Å2/莱苞迪甙E 289.2 Å2)的TWCCSN2分配。我们还确定了甜菊醇和其余甜菊苷的CCS测量值。加标至巧克力酱提取物的甜菊苷的预期^TWCCSN₂值和测定^TWCCSN₂值如下表所示。

甜菊醇和甜菊苷的预期保留时间和预期CCS值

UNIFI组分汇总结果清楚地显示了使用CCS测量值并展示了将ionKey/MS与离子淌度联用的优势。比较预期和测定碰撞截面可得，柱上载样量≤100 pg时，^TWCCSN₂测量值的误差通常<0.4%，质量数测量误差RMS=1.85 ppm。

加标至巧克力酱提取物的甜菊醇和分析甜菊苷的UNIFI组分汇总。三对异构体以彩色星号突出显示，每对异构体都采用CCS实现了明确区分。

UNIFI组分汇总表列出了分析物浓度 1 pg/μL时的分析结果，总体RMS误差为2.72 ppm。但甜茶苷的质量数误差为-7.46 ppm，峰面积响应仅为63。在如此低的浓度下，质量数测定误差受到基质背景中其它丰度更高的离子的影响。我们采用10 ppm的质量数测定容差和2%的CCS%容差进行了数据筛查，确保了痕量(680 fg)甜茶苷鉴定结果的可靠性，同时避免了假阴性检测结果。

加标至巧克力酱提取物的甜菊醇和分析甜菊苷的组分汇总表。三对异构体以彩色星号突出显示，每对异构体都常采用CCS实现了明确区分。

如下图所示，甜菊苷和莱苞迪甙A在7.18分钟处共洗脱。

加标至巧克力酱提取物的甜菊醇和分析甜菊苷的提取质谱图

然而，使用离子淌度分离时，我们在保留时间7.18分钟处得到了两种同量异位的物质(m/z 803.3707)。莱苞迪甙A(棕色m/z 965.4)和共洗脱的甜菊苷(绿色m/z 803.37)在7.19分钟处的保留时间校准多组分谱图如下所示。

UNIFI离子淌度3D数据查看器结果，显示了保留时间7.18分钟处的两种离子淌度分离的化合物(m/z 803.3707)，其计算所得的^TWCCSN₂值分别为261.15 Å2和269.48 Å2。

利用经保留时间和漂移时间校准的“净化”离子淌度产物离子谱图，我们可获得从共洗脱组分中分离的甜菊苷和莱苞迪甙A的单一组分母离子和离子淌度产物离子谱图。离子淌度技术揭示了同分异构体的共洗脱现象，若不进行离子淌度分离，我们将无法观察到该现象。如上图所示，莱苞迪甙A产生了一个源内碎片离子，其CCS为261.15 Å2，而甜菊苷为269.48 Å2。