浅谈特定蛋白检测方法的选择

1977 年, 贝克曼库尔特根据速率散射比浊法原理, 研制成第一台特定蛋白分析系统 ( ICS ) , 它通过测定在反应最高峰时, 抗原抗体复合物合成的速率值, 推得出待测抗原的浓度, 使抗原抗体在结合后几十秒之内得出检测结果, 开创了蛋白免疫分析的新篇章。

散射比浊法测定是基于 Rayleigh-Debye-Mie 散射现象而发展的一种检测技术。当一定波长的光沿水平轴照射溶液, 遇到免疫复合物粒子时, 光线被粒子折射, 发生偏转, 偏转角度与免疫复合物颗粒的大小相关, 通过 Rayleigh 公式推导可得, 90 度与 270 度时的杂散信号最少, 散射光信号最强。

而研究发现, 多数蛋白质分子或免疫复合物颗粒, 均发生 Rayleigh 散射现象。因此, 我们将探测器放置于 90 度角监测散射光信号, 并将该信号转化成待测物质的浓度。

散射比浊法 (Nephelometry) 可分为两种：定时散射比浊法和速率散射比浊法。在定时散射比浊法中, 用来进行浓度确定的测定信号是由两个不同时间点之间的测定值差异所组成的。

速率散射比浊法是一种动力学测定方法。在免疫复合物形成的过程中, 虽然复合物的量与反应时间成正比, 但反应过程并不是以匀速的方式进行的, 以 5 秒为一个单位时间, 观察反应中免疫复合物形成的数量, 将选择散射信号变化最快的速率值 (即速率峰值) 进行监测的方法称为速率散射比浊法。

这种检测方式免去了对反应终点难以准确判断的困惑, 并且降低了缓冲体系所产生的本底信号以及加入抗原样品时浊度信号对抗原抗体反应特异信号造成的干扰, 因此其敏感性和准确性都优于定时散射比浊法。

近年来, 在免疫比浊法的基础上又出现了乳胶增强比浊法。该方法是利用微小的乳胶颗粒 (直径 1μm±) 联接抗体后, 在液相中与相应抗原结合后产生光吸收或光散射的变化量来测定待测抗原含量, 其以朗伯-比尔定律为基础, 广泛运用于生化平台。

乳胶增强比浊技术提高了传统透射免疫比浊法的灵敏度, 也逐步运用于特定蛋白质的检测。虽然基于生化平台的透射比浊法提高了检测速度, 但在检测 IgE、游离轻链等小分子物质时, 准确性尚不如散射比浊法 [1]。在检测低浓度样本时 , 如：脑脊液白蛋白、脑脊液免疫球蛋白, 尿微量蛋白 (尿微量白蛋白、尿转铁蛋白、尿 a1-微球蛋白、尿免疫球蛋白 G), 散射比浊法的检测灵敏度优于透射比浊法且被临床广为采用。

然而, 无论是散射比浊法或是透射比浊法, 都需要实现检测结果的溯源性、标准化和一致性。迄今为止, 血清蛋白检测是临床化学中标准化最好的项目之一, 多数测定项目结果都溯源至 ERM-DA470k/IFCC。

但是, 我们除了需要统一的标准物质之外, 无论采用何种检测技术, 保持检验必需的自动化仪器、试剂、校准品和操作程序的固定组合, 是实现溯源性的前提, 结果准确性的保障。

[1] Nephelometry or turbidimetry for the determination of albumin, ApoA,CRP, haptoglobin, IgM and transthyretin: which choice? Ann Biol Clin 2008 ; 66 (1) : 63-78

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