【知识分享】HILIC模式的分离原理与色谱柱使用

HILIC是一种亲水作用色谱分离模式。是正相色谱的一个“变种”，它避免了使用与水不相溶的有机溶剂，流动相中确含有水，称为反反相色谱或水相正相色谱；用于分离在正相模式下强保留、反相模式下弱保留的极性化合物分析。

虽然HILIC模式已经被广泛地使用于我们的分析实验，但是其保留原理一直存在争议。其中被认可度最高的是——综合了液液分配、氢键作用和离子交换作用的保留原理：

（1）HILIC固定相上的亲水性官能团，可以结合流动相中的水形成一层“富水层”，极性分子首先在“富水层”和流动相之间发生液液分配。不同化合物由于在“富水层”和流动相中分配系数不同而实现分离；

（2）次级保留作用，包括色谱填料表面硅醇基和/或极性官能团与样品分子发生的氢键作用；

（3）离子交换作用发生在带正电荷的分析物与带负电的填料表面硅醇基之间。

同正相模式一样，HILIC模式所采用的固定相，主要是在硅胶载体表面修饰了特定的极性官能团。纳谱分析可提供以下几种HILIC模式的色谱柱：

（1）在HILIC模式中，最常用的有机相是乙腈，比例一般在60-97%之间。在这个区间内，绝大多数化合物的保留都会随着有机相的减少而保留减弱，这是因为在这种低水相的区间内，氢键和/或极性作用会比较明显，因此增加水的比例会比较明显的削弱这些作用从而降低保留;

（2）优先使用醋酸盐或者甲酸盐，因为其在高比例有机相中溶解度较好；尽量避免使用磷酸盐，因为其在高比例有机相中溶解度低，容易造成盐析；

（3）缓冲盐的浓度在5-20 mM为宜，最高不超过200-300 mM，注意其与有机相的互溶，避免析出；

（4）避免使用TFA等离子对试剂，会影响HILIC的分离机理；

（5）THF由于有强氢键作用力也要避免使用；

（6）由于流动相是高比例有机相，雾化效率高，适合与蒸发光、CAD、MS等通用型检测器联用。但是NH₂柱由于其键合相易水解，导致使用这几种检测器时基线噪音大，所以应避免使用；

（7）新柱活化：先用100%乙腈冲洗10倍柱体积，然后起始流动相冲洗20倍柱体积（若起始流动相含盐，需要用同比例有机相/水流动相冲5-10 min，再使用起始流动相冲洗）;

（8）储存：100%乙腈或90%乙腈/10%醋酸铵水（0.1 M，pH5）中。