【王老师带你玩转FlowJo®】之详解高维流式数据分析流程

Step01 样本导入

第一步是样本导入。FlowJo®软件兼容所有流式仪器产生的FCS.文件，我们可以通过拖拽或者点击Add Sample按钮来完成。

Step02 样本分析前处理

-去除异常数据

    通过FlowAI/FlowClean插件，去除异常数据。FlowAI算法能够从流速、信号获取和动态分布三个方面检测原始数据状态。对于异常的数据会自动剔除，计算完毕后，原始数据将分为GoodEvents和BadEvtents。后续的分析则只针对GoodEvents即可。

Tips: 如果需要对样本进行FlowAI算法计算，建议计算出GoodEvents之后再进行去除黏连体等操作。

-矫正批间差异

    很多时候我们的实验会受时间，保存条件，实验操作人员或者仪器状态的影响。比如说不同时间收样等。甚至有的时候会导致阳性群比例发生变化。我们可以使用CytoNorm插件矫正批间差异。每一次实验时最好带上来自同一样本的生物学对照，来拟合矫正实验样本的批间差异。

-数据统一量级

    由于样本制备或者获取端操作的差异，收取的样本数量时常参差不齐。为了更加科学的进行样本间比较，可以利用DowmSample插件对不同的样本进行统一量级操作，让样本间的数量更统一。

Step03 Concatenation数据整合

    样本分析前处理完毕之后，通过Concatenation操作，将所有样本都整合成一个新的FCS.文件。可以保证全部样本在后续都进行相同降维和聚类计算。在整合文件的同时，还可以加入自定义的关键词，用于后续结果的拆分比较。

Step04 降维分析

    降维分析可以将N维的数据降到两个维度，岛上的每一个点代表一个细胞，表达相近的细胞会分布在相同的岛上（相同区域）。让我们在一张二维平面图上就能概览所有细胞和参数的信息。以往可能需要几十张流式图才能表达的内容，在一张降维图就能囊括，对于大数据的分析十分重要。FlowJo®目前有三种降维插件：

* t-SNE

* UMAP

* TriMap

分别对应三种不同的降维算法。

Step05 聚类分析

    聚类算法能够将表达相同的细胞聚为一群。算法全盘考虑所有参数，不受圈门逻辑约束。聚类的结果和降维的结果重叠分析能够更好的反映出样本之间的群体差异同时能够更好的发现稀有群体。目前FlowJo®有FlowSOM/Phenograph/X-shift等聚类算法。

Step06 对比分析，深度挖掘

    在进行降维和聚类分析之后,可以通过关键词拆分整合样本来比较样本之间的差异。拆分的样本可以应用相同的降维和聚类算法，还可以借助ClusterExplorer等可视化的工具对细胞群进行定义和数据深度挖掘。

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