如何运用DOE进行mRNA-LNP靶向T细胞CAR-T疗法脂质纳米颗粒（LNP）配方筛选

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导读：嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR T)疗法是有效的靶向癌症免疫疗法，目前FDA已批准多种CAR T疗法以用于淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的医治，以及HIV等的研发探索。但同时，CAR T疗法不可避免地会致使患者遭受严重的自身免疫相关副作用，以及基因整合风险。mRNA-CAR T细胞正在探索克服这些缺点，电转（Electroporation, EP）作为最常见的T细胞转染方法也可完成mRNA的递送，但又受限于细胞毒性的影响。随着脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle, LNP)技术在COVID-19中的应用，使其成为一个极具价值的mRNA递送平台。

2022年，宾夕法尼亚大学生物工程学院Michael J. Mitchell教授等人在材料高顶刊Nano Letters（IF 11.2）上发表题为“Orthogonal Design of Experiments for Optimization of Lipid Nanoparticles for mRNA Engineering of CAR T Cells”研究型文章。系统筛选、表征和评估不同组成及比例的LNP配方，得到了改善 mRNA 递送至具有低细胞毒性T 细胞的最佳LNP处方。

LNP 通常由可电离脂质、胆固醇、磷脂和脂质锚定 PEG四种主要成分组成。根据在课题组之前的工作，作者筛选了一种性能较佳的新型可电离脂质结构C14-4（图1），与 EP 相比，该结构实现了对 T 细胞的有效 mRNA 递送，细胞毒性降低。如表1所示（节选部分代表性结果），作者利用DOE方法，设计了16种不同的LNP配方。并通过粒径大小、PDI、mRNA浓度和pKa等指标，对上述配方进行了表征与评估。同时，佐以先前优化的S2 LNP配方—可电离脂质: 胆固醇：DOPE：PEG =35:46.5:16:2.5(摩尔比)作对照。

质量检测结果显示，配方库A中，LNP的平均粒径范围为57 ~ 151 nm，PDI值小于0.3（LNP颗粒均匀），mRNA 浓度范围为 3~45 ng/μL。

图1 C14-4可电离脂质信息

为了评估库A中LNP向T 细胞递送mRNA的效果，使用荧光素酶 mRNA 作为内容物进行递送处理Jurkat细胞，48h后对其进行测量（图2A）。结果筛选得到最有递送潜力的4种配方为A10、A11、A12 和 A16，A10、A11 和 A16 被发现在不降低细胞活力的情况下可以产生更高的平均发光值。但总体而言，A16 因其高活力和持续有效的 mRNA 递送为库A中的顶级配方。

同时，根据图1C、1D结果，当LNP配方中有更高的 DOPE 与C14-4比率、更低的胆固醇比率以及适度的 C14-4 和 PEG 比率，可以明显增强mRNA在Jurkat细胞的递送，并最大限度地减少细胞毒性。

图2 不同LNP的表征与评估

根据上述结果，作者进一步缩窄范围对脂质配方库B中12种LNP制剂进行了测试，这些配方都具有高C14-4和DOPE比率，而胆固醇比率保持在低水平，PEG比率保持不变。如表2所示在库B中，LNP大小范围为71.4 ~ 125.1 nm，PDI低于0.3，mRNA 浓度范围为 24.9~ 42.6 ng/μL高于库A。就mRNA递送效果和细胞活力而言，B10为LNP库B中的最佳配方，发光强度比S2高3倍不止。

为了进一步确认A16、B10 2种最佳配方的效能。将它们与S2 LNP同时以不同剂量递送至Jurkat 细胞，并在 48 h 时测量发光和活力。结果显示（图3A）,B10 LNPs在每个剂量下都实现了最有效的递送，而A16仅比对照S2略有改善。同时，进一步将B10与市售转染试剂 lipofectamine 进行了比较（图 3B）。结果与市售试剂相比，两剂B10增强了mRNA的递送，且不会降低活力。这进一步证实了 B10 LNP 是将 mRNA 递送至 T 细胞的有前途的平台。

接下来，作者又在原代人 T 细胞中评估了 S2、A16 和 B10 -LNP 在的 mRNA 递送，以拟合和证实mRNA CAR在临床的可行性。具体为，将从健康供体中分离出的 CD4+和CD8+T 细胞，以1：1的比例混合后使用 Dynabeads 激活。然后用封装荧光素酶 mRNA 的 S2、A16 或 B10 处理这些细胞，并在 24 小时后测量随后的发光情况与细胞活力（图 4）。结果，B10-LNP仍然可以达到最高的荧光素酶表达。因此，来自 Jurkat 和原代人 T 细胞的结果，都验证了B10 为性能最佳的LNP配方。

图3&4 Jurkat 细胞和原代人 T 细胞筛选A16和B10 LNP

为了进一步探索 B10 LNP 的可翻译性，作者继续将 CD19 特异性 CAR mRNA 递送至原代人 T 细胞，用流式细胞术进行表达评估，并以临床标准递送方式EP作为对照（图 5A）。结果，EP 和 B10 LNP产生了较高的平均荧光强度（MFI）值，有效了表达CAR，并且二者的活 T 细胞转染率均高于S2 LNP。

此外，对于CAR T 细胞中CD4⁺和CD8⁺组分，所有治疗组都转染了类似的 T 细胞群。但EP显示出了较高的细胞毒性（存活率55%），而B10 和 S2 LNP 的存活率都>70%（图 5C）。由上述结果可知，B10 LNP展现出了诱导EP相当的强CAR表达能力，且毒性最小。

最后，作者采用表达荧光素酶的 Nalm-6 ALL 细胞与 CAR T 细胞共接种的方式，测定了48小时内CAR T 细胞对癌细胞的杀伤能力。如图5D、5E所示，分别将B10配方与临床标准EP以及商品化慢病毒产生的CAR T细胞进行比较，结果显示各组的癌细胞杀伤相似，证实了B10-LNP生成的 CAR T 细胞对于癌细胞的杀伤能力与当前的临床标准是相当的。

图5 B10 LNP细胞毒性研究

本研究首先参照DOE设计了LNP 库A与LNP库B，以用于筛选向 T 细胞有效递送mRNA、细胞毒性低于 EP的LNP制剂配方。文章首先对设计的28种配方进行了包含粒径大小、mRNA浓度和pKa等初步的表征，筛选得到A16和B102种最佳配方。

随后，又检测了上述两种配方在Jurkat细胞中的mRNA递送能力和细胞毒性，结果B10性能最佳，并且递送能力比S2增加了3倍。

其次，在使用 B10 LNP 将 CAR mRNA 递送至原代人T细胞中时，再次验证了其与 EP 相当的表达和低细胞毒性。最后，在与Nalm-6 ALL细胞的共培养试验中，B10 LNP 生成的 CAR T 细胞能够诱导与 EP 和慢病毒 CAR T 细胞相同的有效癌细胞杀伤。上述结果，均证实了 B10 LNP 是 CAR T 细胞工程的有潜力的递送平台。