甲基化芯片MSA创引疾病表型组研究体系评估

Infinium™ Methylation Screening Array（MSA，270K）

MSA是因美纳今年新推出的一款重点覆盖与常见人类特征、疾病表型、环境暴露、衰老等内容相关的 27 万个独特甲基化位点，使用 Infinium™ EX新芯片制式的甲基化基因芯片产品，专注于面向流行病学基础研究和消费者市场的转化应用。

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因美纳联合博淼生物进行测评

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近日，因美纳联合博淼生物就MSA芯片对于四种不同样本类型（血液、新鲜组织、唾液、FFPE样本）的不同DNA起始量的样本的检出性能进行了一轮测评，结果表明，MSA芯片对样本类型提供了较好的兼容性，全部样本芯片探针质控结果良好，血液与新鲜组织样本的检出率最为稳定，样本平均检出率达到97.9%，唾液与FFPE样本（未经修复）的检出率更具有样本特异性，但样本平均检出率仍旧达到了93.8%。

此外针对两种常见疾病（Alzheimer''s disease、Atherosclerosis）的已知代表易感位点的检出率也进行了小样本测试。尽管由于小样本测试规模的局限性和混杂变量的异质性等因素，测试结果不具备广泛代表性，但检测的结果仍与EPICv2芯片呈现出数据趋势的一致性，证明MSA芯片在临床医学转化研究及大队列样本已知重要位点的验证方面具有积极意义，与EPICv2芯片的医学研究应用场景形成有效呼应。

01

MSA探针质控评估

采用GenomeStudio软件进行MSA芯片探针评估，芯片纳入了一系列质控探针监测整个实验过程，包括非样本依赖型质控：Staining controls、Extension controls、Hybridization controls、Target removal controls和样本依赖型质控：Bisulfite Conversion Controls、Specificity controls、 Non-polymorphic (NP) conrols和Negative controls。最终所有样本探针质控结果均符合参数设置，表明整体实验流程以及芯片质量良好。

① 非样本依赖型质控 

② 样本依赖型质控

02

四种样本类型检测评估

血液样本检出情况

本次测试选用了提取自血液白细胞的DNA样本共4个，分别以50ng、100ng、150ng、200ng、250ng的DNA起始量，选用EZ-96 DNA Methylation Gold™ Kit D5008甲基化转换试剂盒，在同一张芯片的随机位置点样进行了性能测试。结果显示，所有样本均达到了95%以上的甲基化beta值检出率，检出率随着DNA起始量增加略有提升趋势。DNA起始量为50ng的样本1在芯片中位于R12C03，而位于R01C01和R16C01的样本检出率都超过了98%，初步分析结果显示，血液样本在甲基化MSA芯片上任意位置的检出率稳定可靠。

新鲜组织样本检出情况

本次测试选用了来自新鲜组织的4个DNA样本，分别以50ng、100ng、200ng的DNA起始量，在同一张芯片的随机位置进行了性能测试。结果显示，所有样本的检出率均达到了96%及以上，甲基化芯片MSA可以良好的兼容新鲜组织的样本类型。

唾液样本检出情况

本次测试选用了提取自不同个体来源的4个唾液DNA样本，DNA起始量分别为50ng、150ng、250ng，在同一张芯片的随机位置进行了性能测试。结果显示，唾液样本的甲基化位点检出率更具有样本特异性，可能和不同的个体来源或采样途径有关，但10例样本的甲基化位点检出率均超过90%，平均检出率达到96.2%，初步分析判断，甲基化芯片MSA与唾液样本仍旧具有较为良好的兼容性。

FFPE样本检出情况

本次测试选用了提取自3个不同个体来源的FFPE肿瘤样本，未经额外修复，分别在200ng和400ng的DNA起始量下，在同一张芯片的随机位置上进行了性能测试。结果显示，FFPE样本的甲基化位点检出率具有样本特异性，高度取决于样本本身的质量情况。在未经修复的前提下，甲基化芯片MSA检测FFPE类型样本的检出率略逊于其他样本类型，在样本本身较为新鲜、质量较好的前提下，甲基化芯片MSA也能在一定程度上兼容FFPE样本类型。

3个FFPE样本的质检情况如上图，我们可以看到，样本1的DNA片段大部分处于250-1000bp之间，在本次实验中其甲基化位点检出率达到93.8%；样本2的DNA片段在1000bp左右，在本次实验中其甲基化位点检出率达到97.4%；这两个样本的检出率均随着上样量增加而有所提高。而样本3则降解很厉害，大部分在200-300bp，实验中检出率只有82%左右，且随着上样量增加，检出率并没有增加。

测试结果表明样本降解对于MSA芯片的检出率存在一定的影响，建议FFPE样本类型配合使用因美纳公司提供的Infinium™ FFPE DNA Restoration Solution试剂盒进行样本修复，从而提升FFPE样本类型的MSA芯片检测质量和稳定性。

03

两种常见疾病已知位点的统计检测

疾病性状及位点筛选

MSA芯片的位点设计中共覆盖了1000 多项 EWAS 研究结果涉及的位点，本次测试选择了心血管疾病中的动脉粥样硬化（Atherosclerosis）和神经退行性疾病（Alzheimer''s disease）这两种常见疾病作为待测方向。通过EWAS Open Platform中EWAS Atlas数据库提取这两种疾病对应的重要的已知易感位点，为所选位点对应唯一疾病表型的易感位点、样本数量、样本类型等作为筛选条件，最终纳入五个动脉粥样硬化易感位点及四个神经退行性疾病易感位点进行相关测试。

样本类型及数量设计

针对动脉粥样硬化这个疾病表型，本次测试纳入了博淼既往合作项目的阳性和对照血液样本共计20例。针对神经退行性疾病阿尔兹海默症这个疾病表型，本次测试纳入了博淼既往合作项目的阳性和对照唾液样本共计10例*。

*鉴于Transl.Psychiatry(2019)发表的“Genome-wide DNA methylation comparison between live human brain and peripheral tissues within individuals“文章，唾液样本与脑组织样本的甲基化程度相关性较高，故在本次测试中选择了唾液这种样本类型。

甲基化位点统计分析

使用Bioconductor 中的SeSAMe软件包进行MSA芯片数据过滤、质控、校正等前处理，获取标准化校正后的beta矩阵，提炼与上述两种疾病表型对应的九个位点的beta数值，进行DNA甲基化位点的差异分析。

差异分析的结果显示动脉粥样硬化表型对应的五个易感位点中有两个位点符合阳性与对照样本p<0.05的统计意义差异，而神经退行性疾病阿尔兹海默症表型对应的四个易感位点钟有三个位点符合阳性与对照样本p<0.05的统计意义差异。值得说明的是，由于样本数量有限、混杂协变量校正的影响、样本类型的不同、全基因组位点采用靶向分析策略等限制因素，本次测试的统计效力相对有限，仅作为相应疾病表型研究的参考性结论，不具备广泛代表性。

Atherosclerosis表型五个已知位点统计结果

Atherosclerosis表型五个已知位点聚类分析

Alzheimer''s disease表型四个已知位点统计结果

Alzheimer''s disease表型四个已知位点聚类分析

本次测试完整展示了一张MSA芯片全部48个样本对不同样本类型和不同DNA起始量的兼容性，结果显示，在确保足够的DNA起始量的前提下，各种来源的样本类型在MSA芯片上都能获得较为理想的检测结果，这为MSA芯片在不同类型队列上的应用提供了较好的基础保障。通过两个常见疾病表型已知位点的数据统计分析，也呈现了较好的阳性与对照样本的统计学差异，为MSA芯片后续在常见疾病研究、环境流行病等已知位点的筛选验证应用方面提供了支持。

总体来说，MSA芯片在更短的实验周期、更高的样本通量、更环境友好的试剂组分的前提下，实现了对不同样本类型和DNA起始量的良好兼容性。作为因美纳在Infinium™ EX新芯片平台上推出的首款商业化产品，MSA将为研究人类常见性状、常见疾病表型、环境暴露、衰老和细胞类型等领域提供更简便、更实惠且更易获取的解决方案。

参考文献

EWAS Open Platform: integrated data, knowledge and toolkit for epigenome-wide association study Nucleic Acids Res. 2022

Genome-wide DNA methylation comparison between live human brain and peripheral tissues within individuals Transl Psychiatry. 2019

MSA: scalable DNA methylation screening BeadChip for high-throughput trait association studies bioRxiv[Preprint]. 2024

本文转自博淼多组学创新服务公众号