CCK-8 | 细胞活性检测指南

在药物筛选中，如何高效便捷地评价药物分子的细胞毒性呢？做细胞实验的你，还在苦于计算细胞活力吗？T仔这里有妙招奥。

一、关于细胞活力

细胞活力是细胞的重要指标，其定义为某一细胞群体中活细胞的数量。在药物筛选的过程中，通常会通过细胞毒性和增殖试验来测定细胞活力，以评价被试分子是否对细胞增殖有影响或显示细胞毒性作用。

目前已经有多种方法相继被开发用于检测细胞活力、分析药物的细胞毒性和增殖抑制作用，这些方法依赖于不同的细胞功能发挥作用，包括细胞膜通透性、染料摄取、代谢活性、酶释放、细胞粘附、ATP 产生、辅酶产生、DNA 合成和核苷酸摄取活性等。

其中，基于细胞膜通透性原理的染料排除法是最简便的细胞毒性分析方法。此外，基于细胞代谢的细胞增殖分析方法包括 MTT, XTT, MTS, WST1, Alamar Blue，钙黄绿素 AM，LDH 释放检测，G6PD 释放检测。另一方面，基于 DNA 合成或细胞增殖标记物的方法也的得到了广泛使用，例如 H3 标记胸腺嘧啶核苷，BrdU，PCNA，磷酸组蛋白 H3，Ki-67。此外，ATP 检测、磺基罗丹明B 测定、细胞克隆形成实验等也是分析细胞增殖的有效方法。

下面我们来看看几种具体的方法介绍吧。

二、细胞活力检测方法

（一）染料排除法 

染料排除法的原理是活细胞能够将一些染料排除在外而死细胞无法做到，这是因为活细胞具有完整的细胞膜，对于通过膜通道的小分子具有高度的选择性。

台盼蓝（Diphenyl Blue）是一种带负电荷的约 960 Da 的重氮染料，它只能透过损坏的细胞膜，被死细胞吸收。这种染料可以在体外使用，如细胞培养；也可以在体内使用，如观察活体中的癌细胞群；它还可用于比较不同组别在特定条件下的活细胞数量或增殖率。台盼蓝在实验室的细胞计数中应用广泛，死细胞染色后在显微镜下会变蓝，活细胞不染色，且外观清晰。

尽管这种方法有许多优点，包括经济、易于应用，但它无法区分细胞凋亡或坏死，且灵敏度非常有限。

（二）基于细胞代谢的增殖分析实验

1.MTT 法

MTT 法基于 MTT 在线粒体 NAD(P)H 依赖型氧化还原酶催化下转化成不溶性甲瓒，生成的甲瓒可以反映线粒体的活性，并可由此来确定活细胞的数量。增殖细胞具有更高的 MTT 转化率，而缓慢生长细胞的低代谢率导致了较低的 MTT 转化率。应用 MTT之后，用 DMSO 或者洗涤剂十二烷基硫酸钠去溶解甲瓒晶体，甲瓒的浓度便可以利用分光光度计进行检测，波长范围为 540 到 720 nm。

MTT 法最常用于分析药物在不同条件或者浓度的细胞毒性作用，也可用于比较药物组和对照组细胞活力从而测定药物的 IC50 值，有助于确定药物的体外作用以及预测临床应用。另一方面，由于检测期间会杀死所有细胞，因此该方法可能会对后续的研究带来不便。此外，它无法区分细胞毒性和细胞抑制作用，在细胞数目较少时结果可信度不高。

MTT 法原理【线粒体 NADH 通过脱氢酶转化为 NAD+，该反应导致活细胞中的黄色四氮唑盐（MTT、XTT、MTS 和 WST）还原为紫色的甲瓒晶体。】

2.XTT 法

与 MTT 相同，XTT 也是一种四氮唑盐，可用于细胞活力的比色分析。XTT 法同样基于线粒体 NADH 酶可将 XTT 转化为甲瓒晶体的原理，但与 MTT 法不同的是，XTT 法产生的是水溶性甲瓒晶体，可以直接溶解于培养基中，因此省略了溶解步骤。相比于 MTT 法，XTT 法更易应用且更适用于真菌的研究。此外，有研究认为 XTT 法比 MTT 法更为敏感，相较于其它基于四氮唑盐的检测有更大的应用范围。

3.MTS 法

MTS 是在 MTT 和 XTT 之后被报道的另一种四氮唑盐，它是一种电子偶联剂，在 5-甲基吩嗪硫酸甲酯即 PMS 存在的情况下会被活细胞中的线粒体还原酶转化为甲瓒晶体。产生的水溶性甲瓒晶体可以直接溶解在培养基中，无需溶解步骤，可在 490-500 nm 范围内被检测。此外，与 MTT 或 XTT 相比，MTS 溶液具有更高的储存稳定性。MTS 法可用于检测细胞对各种细胞因子、生长因子、细胞毒性药物和抗癌药物的反应。

4.⭐WST 法

水溶性四氮唑盐即 WST 已被开发为新一代的细胞活性测定化合物，它同样可在活细胞线粒体中的NADH酶作用下转化为甲瓒晶体。此外，在 PMS 存在的情况下，WST-1 和 WST-8 比 XTT 及 MTS 结果稳定性更好、检测灵敏度更高。此外，WST 法无需额外的晶体溶解步骤，其试剂具有即开即用的特点，能够帮助研究者更快地完成实验。

5.乳酸脱氢酶释放实验

为了分析药物对免疫细胞的毒性，研究者开发出了乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验。LDH 是可溶性的细胞质酶，在坏死或凋亡细胞的细胞膜破损之后被释放到细胞培养基中，因此，检测 LDH 的活性可以反映药物或者环境因素的细胞毒性。

测定培养基中 LDH 的活性包括两步：

（1）在 LDH 的催化下，乳酸转化为丙酮酸，NAD+ 还原为 NADH；

（2）利用产生的 NADH，黄递酶将四唑盐即 INT 转化为红色的甲瓒产物，出现的甲瓒可在 490-520nm 用分光光度计进行比色测定。甲瓒的水平与培养基中的 LDH 活性呈正相关，可以通过甲瓒的水平来反映 LDH 活性。

然而，培养基中的 LDH 水平可能会受到内源性 LDH 活性的污染，并导致产生假阳性的结果，因此该方法需要进一步的确认。此外，LDH 易降解、检测敏感度不高等缺点限制了该方法的应用。

LDH 释放实验

【损伤或死亡细胞释放的 LDH 催化乳酸氧化为丙酮酸，NAD+ 还原为 NADH 分子。产生的 NADH 被黄递酶用于将  INT（四氮唑盐）转化为红色甲瓒晶体，并进行比色测量。】

（三）腺苷5''-三磷酸测定法

腺苷5''-三磷酸即 ATP ，是生物体的主要能量来源，主要产生于线粒体。ATP 高能磷酸键提供的能量能够用于细胞内所有需要能量的过程。检测细胞总 ATP 水平可以反映细胞活力以及药物对细胞的毒性作用。

ATP 测定法基于生物发光手段检测 ATP 水平。通过添加天然的萤火虫荧光素酶和荧光素在细胞 ATP 参与下发生反应产生荧光，可通过光度计进行检测。发光的程度与细胞活力呈正相关。

与其他方法相比，ATP 测定法具有时间短、灵敏度高、使用范围广等优点。发光信号还可以存在较长一段时间，使测量步骤更容易。但由于 ATP 水平的降低与细胞数量、细胞状态等多种情况相关，因此无法区分药物的细胞抑制或毒性作用。此外，有研究表明在检测铂耐药上皮性卵巢癌肿瘤对其他药物的耐药性或敏感性方面，ATP 检测法比其他方法更准确。

LDH释放实验

（荧光素酶利用细胞 ATP 催化外源性荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素产生的荧光被光度计捕捉并测量。）

三、关于CCK-8

TargetMol® 可以提供细胞毒性和增殖抑制分析方法中用到的各种试剂。此外，我们还提供 CCK-8试剂盒（含WTS-8、1-Methoxy PMS），进一步让您的细胞实验如虎添翼。

CCK-8⼯作原理示意图

产品介绍：

TargetMol® Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 试剂盒通过采用水溶性四唑盐 WST-8 实现快速检测，其原理是 WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒染料。

通过比色，可以动态地量化活细胞的数量，从而对细胞增殖或药物毒性进行检测。CCK-8 试剂可直接加入到细胞中，不需要与其它组分预混，操作方便，检测准确。

产品优势：

1. 操作更简单，无需有机溶剂；

2. 对细胞无毒性；

3. 试剂稳定，即开即用；

4. CCK-8 的检测灵敏度高于其他方法（如MTT，XTT 或 WST-1）。

产品应用：

1. 细胞增殖测定；

2. 细胞毒性实验；

3. 细胞活力检测；

4. 抗肿瘤药物筛选。

操作说明：

1. 接种细胞悬液 100μL 于 96 孔板，在细胞培养箱中（37°C，5％ CO2）孵育；

2. 取出需要检测的细胞，于细胞培养液中直接加入 1/10 体积的 CCK-8，充分混合，保证孔中颜色均一，但不可有气泡产生；

3. 继续于细胞培养箱中培养 1-4 小时；

4. 酶标仪读数之前，置于孔板，于摇床振荡约 1 min，确保孔板颜色均匀；

5. 用酶标仪读取 450nm 光吸收值，计算细胞活性；

6. 可选步骤：在 100μL 细胞中加入 10μL 3％SDS 以终止反应，可在 3 天内读取数据。

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细胞活性测定产品推荐

名称

产品编号

CCK-8

C0005

MTT

T19029

WST-1

T20067

WST-8

T4018

1-Methoxy PMS

T4172

Fluorescein（荧光素）

T1392

Diphenyl Blue（台盼蓝）

T18979

Luciferase（荧光素酶）

TP1344

参考文献：

Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513