Nat Microbiol项目文章 | 浙大胡宝兰教授团队发现全球第一株全程反硝化型厌氧甲烷氧化菌

反硝化作用是全球氮循环中不可或缺的一部分。甲烷是反硝化的合适电子供体，甲烷依赖性脱氮可以同时有助于缓解甲烷排放，并有助于防止氮氧化物的积聚。甲烷依赖性反硝化主要由硝酸盐和亚硝酸盐依赖性甲烷氧化组成，由两组不同的微生物介导。然而，没有直接的实验证据表明在单个生物体中完全脱氮与甲烷氧化相结合。

近日，浙江大学环境资源科学学院胡宝兰教授团队在国际顶级期刊《Nature Microbiology》（IF=28.3）发表题为“Methane-dependent complete denitrification by a single Methylomirabilis bacterium”的研究成果，该研究从稻田土壤中富集分离得到一株厌氧甲烷氧化细菌Ca. Methylomirabilis sinica（M. sinica），并首次证实了该菌独立催化的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程。该研究的发现打破了“两步式”反硝化型厌氧甲烷氧化的传统概念，该全新的生化过程可能会对全球甲烷和氮素循环产生重要影响。青莲百奥为该研究提供宏蛋白组和多组学分析服务。

文章标题：Methane-dependent complete denitrification by a single Methylomirabilis bacterium

发表期刊：Nature Microbiology

影响因子：28.3

发表时间：2024年1月16日

发表单位：浙江大学

研究思路

研究结果

一、Candidatus Methylomirabilis细菌的富集培养

获得的Methylomirabilis细菌为主导的富集培养物中硝酸盐的去除速率从0.16±0.01增加到65.78± 4.60μmol l-1h-1（图1a）。高通量测序结果表明，Methylomirabilis细菌的相对丰度从富集源中的2.6%增加至第380天时的73.5%。此外，Methylomirabilis细菌的丰度也从1.10×107增加到3.21×1012copies g-1（16S rRNA基因拷贝数）（图1a,b），该丰度结果也通过荧光原位杂交（FISH）镜检得到再次证实（图1c-d）。值得注意的是，ANME-2d古菌在整个反应器运行过程中几乎检测不到，这可能是由于反应器中存在的微量氧气致使Mcr失活从而抑制了ANME-2d古菌的生长，而对于利用甲烷单加氧酶（pMMO）的Methylomirabilis细菌来说，微量氧气对其几乎没有负面影响。

二、富集培养物的宏基因组分析

富集阶段培养物的宏基因组测序获得了34个高质量的拼接基因组（MAGs），其中就包括了一个隶属Methylomirabilis属的基因组MAG359。进一步，通过基因组分析结合Sanger测序得到该菌株的16S rRNA基因全长序列，比对后发现该菌株与本课题前期命名的M.sinica相似度高达99.4%，从而确定了该菌株的系统发育地位。与其他Methylomirabilis细菌类似，M.sinica（MAG359）编码了从硝酸盐到亚硝酸盐、一氧化氮再到氮气的完全反硝化所需的所有基因，包括周质空间型硝酸盐还原酶NapAB、细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶NirS和一氧化氮歧化酶Nod编码基因。此外，为了进一步明晰M.sinica在系统发育层面与其他Methylomirabilis细菌的差异，本研究分别基于基因组以及代表性功能基因napA和pmoA的氨基酸序列进行系统发育树构建（图2）。结果表明，M. sinica与目前已知的Methylomirabilis细菌存在一定系统发育学距离，预示着该菌株很可能具备不同的代谢潜力。

三、由Ca.M.sinica独立完成的全程反硝化型厌氧甲烷氧化

对纯化培养物进行同位素培养实验，结果表明，在培养体系中几乎所有被消耗的13CH4均转化为13CO2（图3a），且M.sinica几乎也将所有15NO3-按化学计量比还原为30N2（图3b）。基于化学计量衡算发现，在纯化培养体系中，13CO2和30N2的生成速率分别为0.251±0.002μmol h-1和0.199±0.012μmol h-1，其比值（r13CO2/r30N2）为1.263±0.066，非常接近理论化学计量比1.25（图3c）。值得注意的是，通常情况下，在由甲烷或丙烷驱动的全程反硝化的微生物体系中，由于不同微生物间的协同代谢，亚硝酸盐常会作为中间产物在胞外积累。而本研究中，在整个反应过程中均未检测到中间产物15NO2-的胞外积累。此外，在对照组中，13CH4和15NO3均无法单独被消耗。至此，本研究证实了由M.sinica独立执行的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程。

四、Ca. M. sinica中关键功能基因的表达情况

转录组的结果表明，富集物中M.sinica对硝酸盐还原的贡献度达54.4±1.2%，对亚硝酸盐还原的贡献度达70.9±4.0%，而对最终氮气生成的贡献度则达到了79.4±11.2%。有趣的是，在纯化培养物中，nap基因的转录水平高于nir基因，这是在以往研究中从未被报道过的现象，说明M.sinica具有较强的硝酸盐还原能力（图4a）。此外，虽然也检测到传统的一氧化氮还原酶基因的转录，但其转录水平远低于一氧化氮歧化酶nod，这也与最终氮气的生成现象相互支撑（图4a）。蛋白组的结果表明，富集物中M.sinica对硝酸盐还原、亚硝酸盐还原和氮气的生成均有较高的贡献度，分别达到了70.9± 8.8%、78.4±10.3%和100±0%。此外，在纯化培养体系中也检测到了高丰度的反硝化和甲烷氧化功能酶（图4b）。与转录组结果类似，其中Nap的表达水平同样高于Nir，且仅检测到了高丰度Nod的存在，而几乎检测不到传统一氧化氮还原酶的存在（图4b）。

五、全程反硝化型厌氧甲烷氧化的反应动力学

对纯化培养物进场反应动力学实验以测定M.sinica对不同底物（NO₃^-和NO₂^-）的亲和力。基于米氏方程分析可知，M.sinica对NO3-的半饱和常数Km为10.5±0.9μM，硝酸盐还原最大速率为88.7± 8.7μM h-1 g-1（图5a）；M.sinica对NO2-的半饱和常数Km为15.3±0.9μM，亚硝酸盐还原最大速率为156.8±7.2μM h-1g-1（图5b）。Km是微生物基质亲和力的重要衡量参数，而基质亲和力又是微生物重要的生理特性，对其生长代谢和生态位竞争都有重要的影响。虽然M.sinica对NO2-的半饱和常数达到μM级别，但较其他NO2-利用者，M.sinica可能不具备相应的竞争力。通过对比NO3-的亲和常数发现，M.sinica对NO3-的亲和力比DAMO古菌和大部分传统的反硝化菌更强。该结果表明M.sinica可能会利用更高的硝酸盐亲和力在自然生境，特别是低硝酸盐含量的寡营养生境获得更强的竞争优势。上述推测也在寡营养（5μM NO3-/NO2-）和富营养（500μM NO3-/NO2-）模拟培养中得到验证：在营养充足的条件下，无论是NO3-还是NO2-均能促进M.sinica的生长，且NO2-的存在可使M.sinica生长更佳（图5e,f）；而在仅提供5μM NO3-的条件下，虽然M. sinica的16S rRNA基因的拷贝数轻微降低，从1.33×1011降至1.29×1011 copies g-1，但其相对丰度从40.3%上升至55.6%（图5c,d）。该结果证实了具有更高硝酸盐亲和力的M.sinica在氮素缺乏的寡营养生境中具有更强的适应力和生长优势。

六、Ca. M. sinica的潜在生态意义

将该菌16S rRNA基因的全长序列在NCBI的SRA库中进行比对，发现M.sinica广泛分布于全球各类生境，包括淡水、湿地、土壤及海洋等生境，其中相对丰度最高可达5.9%。上述结果暗示了M.sinica介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化反应是一个全球广泛分布但以往被忽视的碳氮循环新过程。

研究结论

该研究针对厌氧甲烷氧化菌富集分离的难点科学问题，经过1000余天成功获得了全球第一株和唯一一株反硝化型厌氧甲烷氧化菌的纯化培养物，首次证实了该菌独立介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化过程，并深入解析了该功能菌的微生物学机制。改研究丰富了对全球碳氮循环的认识，为水处理潜在工艺开发提供了科学支撑。

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