糖衍生化后的GC-MS分析(1)：分析挑战和分析方法

2023-12-13 12:22:31, Restek 瑞思泰康科技（北京）有限公司上海分公司

糖是生物最原始的渴望之一，它摄入能为人体快速注入能量，它调和着充盈着味蕾，而过少或过量的摄入则会导致低血糖、糖尿病等...

糖作为一种和我们的日常生活及营养健康息息相关的成分，对它的有效分析无疑是一个长盛不衰的重要课题。糖分析方法有哪些？怎样才能做到有效分析？对此，Restek 将以 4 篇干货组成系列，与您一起系统探讨糖分析的难点与要点。今天，我们为大家带来的是第 1 部分——糖分析的挑战及不同的分析方法。

糖分析的挑战

Restek GC-MS Analysis

Restek 在评估 Rtx-225 的性能和选择性时，查阅了许多使用 225 固定相的色谱柱分离衍生糖的论文，特别是分离醛糖醇的乙酯衍生物。糖关乎营养、医学和能量等多个领域，与健康、安全和可持续性等主题密切相关。

考虑到糖分析的广泛应用，通用的衍生化方法非常值得关注。额外的化学反应通常对研究人员来说是个麻烦，但对于糖来说却是必要的。糖的极性很高，这使得用 LC 方法分离变得困难；同时糖又是非挥发性的，这又使之难以用 GC 方法进行分离。通过衍生化，可以调整极性或挥发性，以提高 GC 和 LC 系统的性能。质谱检测器在分析未知的糖混合物时非常有用，但使用 LC 和 UV 或 RI 检测器也可以不通过衍生完成糖的分析。

糖分析的 GC 方法

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对于 GC 分析，有各种衍生化方法，但最常见有甲硅烷基化或乙酰化。1979 年，Knapp 等人提出，三甲基硅烷基（TMS）衍生是分析糖的首选方法，尽管它们会产生多种异构体并出现对应色谱峰。

而 Haas 等人的最近的工作（2018）表明，在 TMS 或三氟乙酰基（TFA）衍生化之前添加肟化步骤可将异构体（和色谱峰）的数量减少到只有两个，并改善混合物的分离。Lv 等人（2015）也证明了在药物化学中醛糖醇乙酸酯是优选的衍生物。TFA- 或 TMS- 肟化方法对多种糖简单有效，但会产生两种异构体（图1），这可能会使定量复杂化。醛糖醇乙酰化方法仅会有效产生一个衍生物峰（图1），但当羰基还原为羟基时，多种糖可能会产生相同的衍生物，如阿拉伯糖和来苏糖。

糖的鉴定是一个迷人而复杂的领域，在这一系列文章中，我们将重点研究几种常见的、相对简单的糖（鼠李糖、甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、核糖、果糖和阿拉伯糖）的色谱性能，使用三种衍生方法：TMS 肟化、TFA 肟化和醛糖醇乙酰化。

图1：各种葡萄糖衍生物的化学结构

如何通过 GC-MS 有效分析糖

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在这个系列文章中，我们将详细介绍通过 GC-MS 分析糖的经验。TMS- 和 TFA 肟化的方法是基于 Haas 等人所述的方法，而我们生成醛糖醇乙酸酯的方法则是 Reay 等人及 Englyst 等人所述方法的简化组合。这三种方法都涉及两步衍生化。正如预期的那样，醛糖醇乙酸酯为每个衍生糖产生一个峰，而 TMS- 和 TFA 肟分别产生两个峰。

表1：GC-MS 分析前糖衍生化的方法

醛糖醇乙酸酯	TMS-肟	TFA-肟
1. 将 2mg 糖溶于 60μL 的 10 mg/L 硼氢化钠的 n-甲基咪唑溶液和 250μL 水中，然后在 37℃ 下加热 90 分钟，然后用 20μL 冰醋酸终止反应。 2. 让样品冷却至室温约 5 分钟，加入 600 uL 乙酸酐，然后在 37℃ 下再次加热 45 分钟。 3. 通过冷冻样品（-15℃） 15 分钟来停止反应。 4. 小心地通过滴加 2.5 毫升水来终止。 5. 用 2 mL 氯仿（下层）萃取三次，合并，蒸发至干，然后用 1.5 mL 氯仿复溶。醛糖醇乙酸酯衍生物的最终浓度应为约 1.33 mg/mL。	1. 将 2mg 糖溶于 200 uL 的 40 mg/mL 环氧乙烷的吡啶溶液中，并在 70℃ 下加热 30 分钟。 2. 让样品冷却至室温约 5 分钟，然后加入 120 uL BSTFA，并在 70℃ 下加热 30 分钟。 3. 在 320 uL 乙酸乙酯中稀释，使 TMS 肟在乙酸乙酯中的最终浓度约为 3.125 mg/mL。	1. 将 2mg 糖溶于 200 uL 的 40 mg/mL 环氧乙烷的吡啶溶液中，并在 70℃ 下加热 30 分钟。 2. 让样品冷却至室温约 5 分钟，然后加入120 uL MBTFA，并在 70℃ 下加热 30 分钟。 3. 在 320 uL 乙酸乙酯中稀释，使 TFA 肟在乙酸乙酯中的最终浓度约为 3.125 mg/mL。

BSTFA 和 MBTFA 对水十分敏感。而糖是吸湿性的，很容易从空气中吸收水分，因此所有样品在分析前都要储存在干燥器中。我们使用 BSTFA 的衍生化很成功，但在进行 MBTFA 衍生时遇到了问题。对此的推测是，在 MBTFA 衍生方面的困难与样品或试剂中存在水有关，我们再添加 30-60 mg 5A，8/12 的粉碎分子筛（在 300℃ 下活化 2 小时，然后冷却至室温）。分子筛改善了 MBTFA 的衍生化，但似乎降低了峰高——这可能是由于衍生糖中除了存在的水之外还存在一些其它问题。将分子筛用于定量方法还需要更多的验证工作，但它对于定性目的是有效的。

糖分析系列

Rtx-225 的性能因三种衍生方法而异。本系列文章的第 2 篇将探讨使用 Rtx-225 分离不同衍生物的效果、以及如何使用 Pro EZGC 助力您的分离优化研究。第 3 篇将讨论仪器维护的良好习惯，最后一篇将探讨 TMS 肟化衍生的自动化。

Restek 系列干货将带您一网打尽糖分析的难点与要点，敬请期待哦！