Q&A | 液相色谱柱常见问题解答（一）

2024-06-17 12:59:25, Restek 瑞思泰康科技（北京）有限公司上海分公司

在往期推文《最新指南！Restek液相色谱柱的使用与维护》中，我们向大家介绍了 Restek 液相柱出厂报告查询方法、液相柱的安装、不同类型色谱柱的平衡和维护方法。

然而大家在实际操作中，仍然可能会遇到一些棘手的问题。今天我们就汇总了一些液相色谱柱使用过程中的常见问题，并给出针对性的解决方案。快来看看是不是问到了你的心坎上呢？

问题 1：我的液相色谱柱上进样量多少合适，同时可以避免谱带展宽？

进样量以及最佳流速受色谱柱尺寸限制。理想情况下，如果样品与流动相使用相同的溶剂，进样量范围如下：

液相柱内径 ID

进样量 (µL)

2.1 mm (30 -100 mm 长)

1-3

3.0-3.2 mm (50-150 mm 长)

2-12

4.6 mm (50-250 mm 长)

8-40

问题 2：如果我改用其它尺寸的色谱柱，应该如何调整进样量？

最佳进样量与色谱柱的柱体积相关，因此取决于色谱柱的横截面积（A = π r2）和长度（L）。您可以根据现有方法的进样量估算调整后的进样量。如果要转换为不同内径（ID）的色谱柱（包装材料和长度保持不变），只需将当前进样量乘以新旧色谱柱的半径平方之比即可确定新方法的正确进样量。

例如，如果当前在 150 x 4.6 mm 色谱柱上进样量为 20 μL，准备切换到 150 x 3.0 mm 的色谱柱，则新色谱柱进样量为 20 x (1.52) / (2.32)，约为 8.5 μL。

问题 3：如果样品/标准品所使用溶剂比我的初始流动相洗脱能力强，会发生什么情况？

图 1：溶剂效应对峰形的影响

会发生溶剂效应，通常会导致峰变形、灵敏度差和保留时间缩短等问题。例如毒物分析中的吗啡、PFAS 分析中的 PFBA 会容易受溶剂效应影响，因此我们建议使用与初始流动相相近的溶剂来避免溶剂效应。如果不便于这样做，请在确保溶剂与流动相可以混溶的前提下尽量减小进样体积来消弱溶剂效应。

问题 4：如何确定液相色谱柱的总柱体积或空隙体积？

术语“色谱柱体积”通常是指空隙体积，它代表二氧化硅颗粒之间的流动相体积。空隙体积可以通过总柱体积（ π r2 L）乘以对应色谱柱的装填系数来获得。对于全多孔色谱柱，计算空隙体积（mL）的公式为 V = 0.68 π r2 L，其中 V = 柱体积，单位为 mL；r = 柱截面半径，单位为厘米；L = 柱长，单位为厘米。对于表面多孔的色谱柱，例如我们的 Raptor 色谱柱，系数不同，空隙体积（mL）的公式为 V = 0.50π r2L 。

空隙体积通常通过进特定标准品进行实验测定，该标准品需要在待测色谱柱上无保留或保留可以忽略不计。反相色谱柱常用测试化合物是尿嘧啶。需要注意的是，对于所使用的特定液相仪器，测定值还受到柱外死体积的影响，因此可能会略有不同。

问题 5：使用惰性色谱柱有什么好处？哪类化合物更适合用 Inert 惰性液相柱分析？

当通过 HPLC 分析金属敏感化合物时，流路中最大的金属面积是液相色谱柱的柱管。对柱管内壁进行惰性化处理的 Inert 色谱柱，可以消除金属敏感化合物与金属之间的非特异性吸附。从而为这类化合物提供更好的峰形和响应。

这类化合物包括：磷酸类化合物、酸性化合物、生物分子-蛋白质、核苷酸、寡核苷酸等。