临床样本中类固醇激素前处理解决方案-SPE

2023-12-02 21:31:57, 王静艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

类固醇激素，又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，因其在维持生命、调节性功能、对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面的作用，临床表征中经常会作为疾病诊断的参考，因此，相关激素在临床样本中准确的定性和定量分析就变得尤为重要。在上周的推文中，我们分享了用LC-MS/MS方法检测临床19种类固醇激素的解决方案，该方案的完整执行，离不开合适的前处理基础，这周我们就为大家分享其中一种基于SPE的前处理方法。

整个SPE方案的考察过程中，我们对淋洗和洗脱方案进行了相应优化。对于淋洗方案，首先尝试了甲醇与水的不同比例，从10%的甲醇/水增加到90%的甲醇/水，其中最好的结果为30%甲醇/水的比例。而后接着尝试了两种洗脱方案，第一种为1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗，第二种为30%甲醇/水淋洗后采用正己烷淋洗。对于所有淋洗方案来说，1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗的方式回收率最佳。在洗脱方案中，同样进行了一些尝试，最终决定采用甲醇:乙腈（1/4）进行洗脱。以下为优化后的SPE方案：

步骤	操作
样品预处理	500µL血清样本与500µL 1%甲酸水混合
活化	1mL甲醇活化Strata-X, 33µm聚合物反相，30mg 96孔板（货号: 8E-S100-TGB）
平衡	1mL水
上样	1mL预处理后的样品（10µL内标）
淋洗1	1mL 1%的甲酸水溶液
淋洗2	1mL 30%的甲醇/水溶液，真空抽干
洗脱	2X500µL甲醇:乙腈（1:4, V:V）
氮吹浓缩	45℃
复溶	100µL 0.5mM的氟化铵水溶液/甲醇（60:40, V:V）溶液

图3 Kinetex C18分离类固醇相关异构体总离子流图

图4 部分化合物标准曲线

表3 标准曲线，LLOQ和S/N结果汇总

Kinetex 2.6µm C18色谱柱在正离子和负离子模式下能对分析物提供8分钟之内的高选择性分析结果（见图3）。具有相同质荷比的异构体也完成了分离。标准曲线线性良好，分析物R²均大于0.99（见表3）。三种浓度下的三份加标样品的准确度为80%~120%。除DHEAS回收率为54%之外，其他所有分析物的低浓度加标样品的回收率为81%~116%；除DHEAS回收率为61%之外，所有其他分析物中浓度加标样品的回收率为80%~96%；除DHEAS回收率为59%之外，所有其他分析物高浓度加标样品的回收率为82%~102%（见表4）。要提高DHEAS的回收率，就要采用不同的洗脱方案。分析物的加标样品精密度（%RSD）均小于15%（见表5）。