经验分享-癌症易感因子及潜在治疗药物的高通量细胞筛选方案

加拿大 Manitoba 大学的生物化学与遗传医学部的 McManus 博士，同时也是 Manitoba 癌症中心的高级科学家，他的主要工作是致力于寻找癌症易感群体的异常基因，以及筛选针对这些变异基因的治疗药物。

McManus 博士的研究团队（本文封面图片）通过细胞学实验以及成像分析的方法研究及鉴定了多种导致基因组不稳定的遗传学高危因子，研究普遍结论认为此类基因突变会导致一些癌症的发病，包括结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等。这些基因通常和 DNA 的损伤修复相关，其突变会引起染色体数量异常，肿瘤生长转移和患者预后较差。

DNA 损伤有许多不同的形式，如碱基修饰，DNA 单链断裂 (DNA single stranded breaks, SSBs)，DNA 链内和链间交联以及 DNA 双链断裂 (DNA double stranded breaks, DSBs) 等，其中 DSBs 被认为是 DNA 最严重的损伤，因此也成为诸多癌症易感基因的生物学评价标准及治疗靶点。

关于 DSBs 的检测方法，此前我们介绍过高通量彗星电泳，它是业内公认的反应 DNA 双链断裂的评价方法，除了彗星电泳之外，gammaH2AX 的检测也是重要的 DSBs 早期标志物，有研究表明其时间效应甚至早于彗星实验的评价。所以 γ-H2AX 的检测体系也是 McManus 博士开展的重要的易感基因评估模型。

细胞在 DSBs 发生后，产生一系列的应激反应，其中一个主要的反应就是毛细血管共济失调突变基因 (ataxia telangiectasia mutated, ATM) 起始的信号级联反应，它使细胞周期停顿直到损伤修复。H2AX 是这一信号级联反应中的一个主要成员，它能被 ATM 磷酸化 (称为 γ-H2AX, 或 gammaH2AX)，并在随后的损伤修复过程中发挥着重要的作用。由于磷酸化的 H2AX 在 DSBs 位点形成焦点 (focus)，且与 DSBs 的发生具有一一对应关系，因此可以作为标志物通过免疫荧光、流式细胞术或免疫印迹的方法检测。

免疫荧光成像检测 γ-H2AX 的方法相对流式细胞术及 WB 更加直观，并且可以评估单细胞水平 γ-H2AX 形成 foci 的数量，但是在不同的研究中，这种镜下观察得到的 H2AX 焦点的大小和荧光强度在不同的条件下可能发生变化，还可能受到非特异性染色的影响，因此，在分析免疫荧光结果时，不仅要分析焦点的多少，同时也要充分考虑到焦点的大小及强度所代表 DNA 损伤的程度。由于传统的荧光显微镜成像方法通量和图像分析功能的限制，往往认为免疫荧光成像检测的定量统计较差。

γ-H2AX 的 foci 检测中存在的定量统计问题，使用Cytation 成像系统能够完美解决。Gen5 成像分析软件的 Dual Mask 功能能够精细圈选每个细胞里的 foci 小点，并且对小点的数量及荧光强度积分进行统计，因此可以反馈每个细胞形成 foci 的情况。我们来看一下这个案例：

给予 U251 细胞系不同浓度的喜树碱，通过成像可观测到细胞内不同数量的 foci 形成。蓝色：DAPI 标记细胞核 红色：CY5 标记的 γ-H2AX 形成的 foci。

Gen5 软件可以对细胞总数进行圈选（图 A），也可以通过 second mask 对细胞内的 foci 进行圈选（图 B），进而 Gen5 软件可以统计出每个细胞内 foci 的总面积和总荧光强度。

通过 Gen5 软件的亚群筛选功能，采用统计学的方法设定阈值，可以挑选出 DNA 损伤应答的细胞群体（红色 Mask 圈选）。

软件可对每个化合物浓度的样品孔进行计算，从而分析不同 γ-H2AX-foci 评估标准下的化合物对 DNA 损伤的作用曲线。

除了 DNA 损伤修复评估模型之外，McManus 博士还开展了基于 3D 细胞模型的不稳定染色体的调节因子筛选。

他们使用 Cytation 3 多功能细胞成像系统进行多重高内涵筛选实验，例如细胞核面积异常增大、微核形成等。而合成致死因子 (Synthetic lethal interactors) 能够针对这些遗传变异成为潜在的消灭癌细胞的治疗靶点，McManus 博士团队还在 Cytation 的平台上进行合成致死因子有效性筛选，成果已在多种知名期刊上发表。

安捷伦 BioTek 为其团队提供了 3D 细胞筛选的整体解决方案，包括 EL406 高通量洗板分液仪，BioSpa8 自动化培养箱，以及 Cytation3 细胞成像系统。正是应用这套系统，McManus 博士团队能够对不同的调节因子影响肿瘤球形成过程进行实时监测，获得的数据相对此前的贴壁细胞培养系统更加贴近在体生理条件。

未来，McManus 博士还将对已鉴定的高位突变基因影响基因组稳定性的机制进行深入研究，并且在其一项临床合作项目中，将应用卵巢癌患者分离的原代肿瘤细胞构建 3D 培养模型开展药物评估，想了解更多的 McManus 博士实验室的工作，请访问其实验室网站http://home.cc.umanitoba.ca/~mcmanusk/index.html。