2023-11-17 13:57:40, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
蛋白组学研究内容:
主要有两方面,一是结构蛋白质组学,二是功能蛋白质组学。
其研究前沿大致分为三个方面:
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞,建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群,即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象,进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用,绘制某个体系的蛋白,即相互作用蛋白质组学,又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
此外,随着蛋白质组学研究的深入,又出现了一些新的研究方向,如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。蛋白质组学是系统生物学的重要研究方法.
蛋白组学技术原理
双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白,对操作要求也较高,但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率,同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合,进行2-DE,用来检测蛋白质在两种样品中表达情况,极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
高效液相色谱技术(HPLC)
尽管二维凝胶电泳(2-DE)是常用的对全蛋白组的分析方法,但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质,并用MALDI-TOF-MS鉴定收集的组分,从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术,不存在相对分子质量和等电点的限制,通过不同模式的组合,消除了二维凝胶电泳的歧视效应,具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换-反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。
质谱技术
最早是MALDI-TOF,MALDI基质辅助激光解吸离子化技术于2002 年由诺贝尔化学奖得主田中发明,刚刚产生便引起学术界的高度重视。MALDI和TOF(飞行时间质谱)搭配是一个理想的快速鉴定技术。最早,SELDI 技术是蛋白质组学研究中比较理想的技术平台,其全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-tof)。其方法主要如下:通常情况下将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上,既可比较两个样品之间的差异蛋白,也可获得样品的蛋白质总览。因此,在应用方面具有显著优势。SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化,因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI 技术可以分析疏水性蛋白质,PI 过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质( < 25 000) ,还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质,增加发现生物标志物的机会。SELDI 技术只需少量样品,在较短时间内就可以得到结果,且试验重复性好,适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物,特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等, 从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。
后来,人们发现SELDI-TOF的数据并不是很理想,由于蛋白质组学的复杂性,SELDI-TOF号称的种种“发现肿瘤Pattern”等被证明是不可靠的。SELDI-TOF当时的过度宣传,和马上被证实的不可靠,被人们抛入了谷底,打入了冷宫。目前,人们认为如果采用MALDI技术,至少要接串联质谱。
在初期的高通量鉴定时代,第一个获胜的技术是MALDI-TOF/TOF,它和2D PAGE连接,实现了生物学家更容易理解的,跑胶-分离提取-质谱鉴定的流程。
与此竞争的技术是2D HPLC-MS(这个MS可以是:LCQ、LTQ、Q-TOF、Orbitrap),这些也都是串联质谱技术。后来2D HPLC-MS技术逐步战胜了MALDI-TOF/TOF技术,因为跑胶,不能在线,也很难重现。当2D HPLC技术克服了重重难关后,越来越多的人放弃了MALDI-TOF/TOF技术。
在高通量鉴定时代之后,进入了更多的Biomarker发现,定量,磷酸化等翻译后修饰鉴定,蛋白-蛋白相互作用等时代。这时的精细鉴定,更需要LC-MS技术,MALDI-TOF/TOF技术就更被人们暂时抛到脑后。直到最近,人们步入到质谱成像阶段,越来越多的医学工作者更加容易信任成像技术,而MALDI成像相对于基于ESI的质谱,更容易实现稳定可靠的成像。
同位素标记亲和标签(ICAT)技术
同位素亲和标签技术是一种用于蛋白质分离分析技术,此技术是蛋白质组研究技术中的核心技术之一。该技术用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸,利用串联质谱技术,对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个不同的峰形,能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同。ICAT 的好处在于它可以对混合样品直接测试;能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等;还可以快速找出重要功能蛋白质。
由于采用了一种全新的ICAT试剂,同时结合了液相色谱和串联质谱,因此不但明显弥补了双向电泳技术的不足,同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速,代表着蛋白质组分析技术的主要发展方向。针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT技术本身又取得了许多有意义的进展,已形成ICA T 系列技术。
生物信息学技术
生物信息学在生命科学研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行处理和分析,也是蛋白质组研究的重要内容。生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学的发展,已不仅是单纯的对基因组、蛋白质组数据的分析,而且可以对已知的或新的基因产物进行全面分析。在蛋白质组数据库中储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息,通过用鼠标点击双向凝胶电泳图谱上的蛋白质点就可获得.
鉴定方法
如蛋白质鉴定结果、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质在不同条件下的表达水平等信息。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST 数据库。NRDB由SWISS2PROT 和GENPETP 等几个数据库组成,dbEST是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑的核酸数据库;计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定软件、蛋白质结构和功能预测软件等。
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