2023-09-28 14:58:45, TAS团队 赛默飞世尔科技生命科学产品
虽然新冠的阴影已经慢慢从我们的生活中抹去,但是想必大家对核酸检测、Ct值等词语依然记忆犹新,而新冠核酸检测是在实时荧光定量PCR(qPCR)仪上完成的众多检测项目之一。qPCR实验虽然简单,但难免会遇到各种小问题:试剂如何使用?软件如何正确设置?数据结果为什么异常?……
“
别急,技术支持团队为您总结了qPCR的常见问题分析,整理成qPCR实验避坑指南。本篇我们节选了部分比较常见的通用问题分享给大家,接下来还会陆续推出QS3/5、7500、StepOnePlus以及试剂的常见问题分析。无论您是新手还是行家,这些问题和解决方案都将对您的实验提供有用的指导,各位赶紧收藏吧!
”
Q1
绝对定量实验,扩增曲线(Amplification Plot)是正常的(图1),但没有显示标准曲线(图2),是什么原因?如图7500软件。
图1
图2A
该数据中将不同浓度的标准品设成了不同的Target(图3),且标准品的Quantity设置也有误,所以无法显示出正常的标准曲线。应该把检测同一个基因的所有标准品孔、样品孔都设为同一个Target,并按标准品浓度或拷贝数填写Quantity。此例可以在Setup->Plate Setup->Assign Targets and Samples界面修改设置后再
图3
图4
Q2
扩增曲线(Amplification Plot)异常,显示为杂乱折线,标准曲线显示为空白(图1),多组分图(Multicomponent Plot )有扩增信号(图2),是什么原因?如图7500 软件。
图1
图2A
该实验中使用了单独添加ROX染料的试剂,在部分孔中添加了ROX染料,部分孔中没有添加ROX染料,而在分析时选择了Passive Reference 为ROX,导致分析后数据出现问题,建议在没有添加ROX染料或ROX染料浓度不合适时,选择Passive Reference 为None(图3),
图3
图4
Q3
实验结束后扩增曲线(Amplification Plot)异常且Ct值显示为 “Undetermined”(图1),这是什么原因?如图QS5 软件。
图1A
查看原始数据的多组分图(Multicomponent Plot),发现所有样本均未扩增(图2)。查看反应程序设置,发现qPCR反应条件设置有误,95℃ 高温变性步骤放在了Hold Stage ,而PCR Stage 中的40个循环只包含了58℃ 退火延伸步骤(图3),因此导致扩增失败,只能重新进行实验。
图2
图3
Q4
染料法进行定量实验,实验结果显示扩增曲线(Amplification Plot)异常(图1),多组分图中(Multicomponent Plot)也显示扩增曲线在基线期就出现了信号的抬升(图2),这是什么原因?如图7500 软件。
图1图2A
通过查看多组分图,发现扩增曲线在基线期信号就有抬升,该现象可能是由于cDNA中有大量基因组DNA污染导致的。当PCR反应中存在一些非平末端的含5’-overhangs双链DNA片段时(图3),Taq DNA聚合酶会结合上去,将这部分缺失的碱基补齐,形成新的双链片段,这时SYBR Green染料就会和新合成的DNA双链发生结合,当这种片段足够多时,就会出现扩增曲线基线期抬升的现象。建议出现这种情况时首先注意检测RNA的质量,RNA提取时使用DNA酶进行消化处理,避免产物中有基因组DNA的污染。
图3
Q5
qPCR实验,耗材使用的是八联管。多次数据第一行的扩增信号和其他行相比很弱(图1,蓝色方框中是第一行样本的扩增信号,红色箭头所指为第二行样本的扩增信号),这是什么原因?如图QS5软件。
图1A
查看原始数据的多组分图(Multicomponent Plot),第一行的原始荧光信号确实是比第二行要低(图2,蓝色方框中为第一行ROX的扩增信号,红色箭头表示的是第二行ROX的扩增信号),初步推测第一行的荧光信号采集时受到了影响。在排查耗材使用和实验操作后,发现是在第一行的管盖上使用了记号笔标记,这会影响仪器对荧光信号的采集,规范实验操作之后实验荧光信号正常。
图2
本期我们摘选了若干个适用于各种机型的常见案例,在下一期中,我们将会为大家送上有关7500这一经典机型的相关案例,敬请期待!
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