前沿应用|低场核磁共振技术在层析填料孔径分布研究中的应用

2023-09-17 10:27:35, 纽迈分析苏州纽迈分析仪器股份有限公司

层析填料的基质一般为交联多糖（琼脂糖、葡聚糖等）、高分子聚合物等。一般根据层析技术原理（凝胶过滤、离子交换、亲和层析、疏水层析、反相层析）、目的物性质等分类选择填料，来满足过滤、分离纯化、批量吸附、提高载药量等生产需要。

层析填料的孔道大小对生物蛋白产品的分离、装载等过程有重要的意义，孔道过大则会导致蛋白全部通过，孔道过小则导致蛋白无法进入孔中，无法有效过滤或装载[1]。蛋白分子尺寸从几纳米到几百纳米不等，因此对不同尺寸的目标对象有效地设计合适的孔径就显得非常关键。

层析填料的孔径在设计过程中，可通过增大孔道，来增加比表面积，增大吸附容量，提高流速，减少介质的用量，可使有限的柱子体积内，增大样品处理量。因此孔道的测定应尽可能的精确[2]。

图一层析填料制备原材料示意图

一

层析填料孔径分布各类检测分析方法的比较

层析填料的孔结构参数，主要包括颗粒尺寸大小、孔径分布、形状、孔隙率等等。其中孔径分布比其他参数重要，要求孔径分布集中，这样以便对目标尺寸的蛋白进行有效过滤或吸附装载。

不同类型的介质其孔径变化范围也不一样，且范围较大，一般从nm级到μm级。

层析填料常用的孔径分布测试方法主要有：氮吸法、压汞法、热孔法、逆体积排阻层析法等[3]。

图二层析填料药物过滤示意图

氮吸法

氮吸法依据的原理是毛细凝聚现象，测量孔径的范围为小于100 nm，所谓氮吸法即是将液氮吸附在多孔材料的表面，然后利用静态法或动态法测定。其中需要利用BET方程来计算表面积。然后利用脱附等温线来计算介质的孔径分布。

其不适用于生物软凝胶介质的孔径分布测试。

压汞法

压汞法的适用范围为3nm-400μm，其主要原理是利用高压将汞压至样品的孔隙中，通过产生的信号，得出孔隙率及比表面积等数据。然后需要利用Washburn方程计算孔径分布。

压汞法主要适用于非润湿多孔材料，不适合于汞齐化的材料，对于软胶介质同样不适用。

热孔法

热孔法其原理是通过热分析仪测得介质中液-固界面处的熔点或冰点的变化，依此来计算介质的孔径及其孔径分布。目前该技术已成功应用于大量多孔材料如氧化铝、硅胶、树脂、丁基橡胶、氧化钛树脂、水凝胶等材料中。

热孔法的优点是在接近环境温度的条件下，测量湿态膜的孔径及孔径分布，无需干燥；缺点是虽与毛细凝聚相似，但是在承压介质中融化-凝固机理尚缺乏了解；计算模型中的参数不是直接得到的，需要进行校正。

逆体积排阻层析法

逆体积排阻层析法是体积排阻色谱（SEC）的反向应用，即以一系列已知分子量的大分子物质（如葡聚糖Dextran、聚丙烯酰胺Polyacrylamide、聚乙二醇PEG等）作为探针，通过示差或者紫外检测器测定它们在层析柱上的分配系数，结合体积排阻色谱模型从分子尺寸和对应的分配系数之间的关系来计算层析介质的孔径分布，并可进一步得到其他孔结构参数的方法。

尽管逆体积排阻层析法测定层析介质的孔结构得到广泛的应用，但该方法同样存在着一定的问题（如该方法是利用葡聚糖标准品测定出的结果其应用于蛋白时会有一定的偏差，其次葡聚糖标准品容易与软凝胶进行耦联结合，从而影响实验结果等），另一方面对于层析条件改变后孔结构变化特点和影响规律，以及对蛋白质吸附和保留行为的影响，这方面的研究还有所欠缺。

低场核磁共振法基于对氢信号的优秀捕捉能力，且不同孔隙尺寸中的氢信号的核磁弛豫分布不同，可以快速有效的得到层析填料的相对孔径分布谱图，测试过程绿色无污染、无损可重复、简便易操作，并且只要有同类别介质的弛豫时间与介质孔径的大小关系作为定标参数，就能够快速的得到介质的孔径大小，及孔径分布等参数[4]。

二

低场核磁共振技术在层析填料孔径分布

测试中的实验方案

琼脂糖凝胶介质保藏液的置换：

于自制的过滤试管中倒入5 mL左右的介质，然后抽滤，用5倍的介质体积的纯水溶液置换琼脂糖凝胶介质四个样品中乙醇溶液，直至出水口全是纯水时为止，注意抽滤过程中不要将介质抽干。

含水琼脂糖凝胶介质弛豫测试：

将样品转移到核磁管中，置于仪器5min后（使介质温度达到仪器恒定的温度），使用CPMG序列采集样品的T2信号。

介质的抽滤过程：

利用真空泵对置换完成的介质进行抽滤，抽滤5 min，直至介质干燥为止。

抽滤后的琼脂糖凝胶介质弛豫测试：

将样品转移到核磁管中，置于仪器5min后（使介质温度达到仪器恒定的温度），使用CPMG序列采集样品的T2信号。

测试完成

测试完成，回收样品，整理设备。

三

低场核磁共振技术在层析填料孔径分布测试中的实验结果以及分析

图三样品未抽滤的核磁T2分布

图四样品抽滤后的核磁T2分布

利用低场核磁法测定出的未抽滤的不同产地的琼脂糖合成的介质的横向弛豫时间图谱如图三所示。

图四为抽滤后介质的横向弛豫时间图谱。抽滤后的4种介质其加权平均弛豫时间分别为89,201,119,118ms，且从图四上可以看出，

抽滤后的样品A介质孔径略小，且分布较窄，说明该样品孔径分布更加集中，能够对大尺寸的蛋白药品有一个很好的过滤效果，装载尺寸较为接近的颗粒药物；

样品B孔径分布相对最宽，且峰面积最大，说明样品B可以装载不同尺寸的颗粒药物，对药物的种类和颗粒大小有很好的包容性；

样品C、D介质峰很接近，说明二者的孔径分布较为接近。

低场核磁共振技术在同类别介质的弛豫时间与介质孔径的大小关系作为定标参数的条件下，可以将T2弛豫谱转换得到孔径分布谱（T2弛豫谱是相对值，孔径分布是绝对值，二者参数之间的转换需要标定参数）。以下为样品A、B、C的孔径分布图。

图五孔径分布图

由结果可知，样品A的孔径分布在32-52nm，样品B的孔径分布在53-79nm，样品C、D的孔径分布在46-64nm。

层析填料孔径分布检测分析

推荐设备：

苏州纽迈核磁共振分析仪PQ001-GU

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参考资料

[1]王晓君, 刘新利, 李秀男, 等. 低场核磁法测定凝胶过滤介质的孔径分布[J]. 化工学报,2013, 64(11):6.

[2] Elwinger F, Wernersson J, Furó, István. SEQ-NMR: A new tool for measuring distribution coefficients and pore size in chromatography media[J]. 2017.

[3] Kilz P, Held D. Inverse size-exclusion chromatography for characterization of pore size distributions[J]. LC GC: magazine of liquid and gas chromatography, 2016, 12(2):11.

[4] Zhang P, Lu S, Li J, et al. Comparisons of SEM, Low-Field NMR, and Mercury Intrusion Capillary Pressure in Characterization of the Pore Size Distribution of Lacustrine Shale: A Case Study on the Dongying Depression, Bohai Bay Basin, China[J]. Energy & Fuels, 2017, 31(9):9232-9239.