科研干货 | 有了CorrectASE酶来纠错，从此，合成基因又快又好！

CorrectASE酶在基因合成中的应用

随着合成生物学、高通量测序、基因编辑、基因治疗等研究领域的蓬勃发展，DNA 合成已逐渐成为一个新兴产业，同时，大家对大规模、高正确率的DNA合成的需求与日俱增。然而，>200 bp 序列的合成仍然成本高昂，为了克服这些限制，人们开发了包括分子组装和克隆方法、不依赖模板的酶法合成、微阵列和滚环扩增等技术。在此，我们将讨论CorrectASE酶在DNA合成过程中所发挥的作用。[1]

图1. 聚合酶循环组装

正如图1所示，1995年发明的聚合酶循环组装(Polymerase Cycling Assembly, PCA)，以单链DNA为起始材料，采用高保真聚合酶，通过PCR延伸来构建长DNA序列；随后，在PCR2中，加入靶DNA的特异性引物进行扩增；最后，通过PCR3扩增靶DNA序列。PCA适合＜5kb的基因组装，但需要采取纠错步骤。

PCA法的基因合成流程

接下来，我们以聚合酶循环组装为例，看看基因是如何合成的？

图 2. 聚合酶循环基因组装（PCA）工作流程示意图

上图中蓝色条代表设计用于覆盖待组装基因或基因片段的重叠寡核苷酸。绿色区域表示用于组装构建体下游操作的可选悬垂区；这些悬垂区可能包含在末端组装寡聚物中，也可能包含在用于 PCR3 的扩增引物中。黑色箭头代表扩增引物。寡聚物合成产生的错误用黄色表示，聚合酶延伸产生的错误用红色表示（仅供参考，并非基于真实错误率）。PCR1 或 PCR2 产物变性后重新断裂，在错误位点产生错配。CorrectASE 酶，可用于识别和切除这些错配。校正后的片段会在 PCR3 中重新组装，从而提高获得无差错克隆的可能性。克隆组装基因构建体，并通过Sanger或NGS验证序列。[2]

其中，CorrectASE 酶的纠错原理如下图所示：

图3. CorrectASE 酶的纠错原理

1. 寡核苷酸初始 PCR 组装后，使用 CorrectASE 酶，对 PCR 产物进行变性、退火，使突变不可匹配，进行孵育。

2. CorrectASE 酶与产生的错配结合，并使错误的 DNA 双链 3’ 产生缺口。酶的 3’ 至 5’ 核酸外切酶活性可消除错误。

3. 使用校正聚合酶进行最终 PCR 组装正确片段，增加正确序列克隆的可能性。[3]

CorrectASE 酶应用场景

在Nucleic Acids Research中有文献评估了10 种不同酶法纠错方法，两轮酶法纠错处理后，CorrectASE酶的错误频率从掺杂错误的Oligo的 45.1 次/kb 降至 7.9 次/kb。其次是 T7 内切酶 I（9.1 错误/kb），MutS（11.2 错误/kb）。[4]由此可见，CorrectASE 酶能够显著提高组装质量。

图4.柱法PCA基因合成中使用纠错酶

在Science  Translational  Medicine 有文献报道了利用寡核苷酸组装 1.7 kb HA 和 1.5 kb NA 病毒基因组时，通过使用CorrectASE酶纠错，降低基因合成中的错误，优化的组装和纠错过程，在21.5小时后，产生可用于转染的基因，合成基因的序列错误率 < 1/9 Kb，获得全长基因序列的正确率≥ 80%，相比于对照组（未纠错组）而言，需要4.5 至 5.5 天时间，正确率是3%。[5]可见，在柱法PCA基因合成中使用纠错酶能够显著降低合成时间和提高全长基因序列的合成正确率。

图5. DNAscript 公司酶法基因合成使用CorrectASE酶

DNAscript 公司的酶法基因合成中，提及到使用 CorrectASE 酶进行纠错，如，PCR2 产物在 50 µL 的 1X CorrectASE 缓冲液中稀释至 25 ng/µL，然后按照说明书进行变性和再退火，每个重新退火的产物（10 µL）与 1 µL CorrectASE 酶在 25°C 孵育 15 分钟。[2]

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