AutoChrom辅助进行SFC方法开发的案例

2023-08-10 15:54:48, ACD/Labs Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)


AutoChrom辅助进行

SFC方法开发的案例

ACD/Labs

2022年,江苏省药检院在Analytical Chemistry上发表了一篇利用超临界色谱结合ACD/AutoChrom辅助分析方法开发技术,建立了硫酸庆大霉素中多种生物胺定量和定性分析方法的应用。ACD/Labs中国区技术团队对于文献中色谱分离条件的筛选及优化过程进行了总结,摘要如下:

引言

生物胺(BAs)是一种低分子量的碱性含氮化合物,主要由氨基酸的脱羧或醛和酮的胺化和反胺化形成,适量的BAs对人体健康有积极作用。然而,当它们富集到较高的浓度,就会引起包括恶心、皮疹、偏头痛、头痛、高血压等不良反应。因此在药物分析中涉及的生物胺需要控制限度并准确定量。

本研究通过计算机辅助建模,建立了庆大霉素中11种Bas【苯乙胺(PEA), 色胺(TYP),酪胺(TYR),组胺(HIS),庚二胺(I.S.),尸胺(CAD),腐胺(PUT),章鱼胺(OTC),亚精胺(SPD),精胺(SPE),胍丁胺(AGM)】的分离测定方法(结构见图1)。

图1 10种生物胺的结构

从上述结构可知,化合物中的脂肪胺在反相色谱体系下保留较弱,且庚二胺(I.S.),尸胺(CAD),腐胺(PUT)亚精胺(SPD),精胺(SPE),胍丁胺(AGM)无显著的UV响应,常规的液相方法开发策略无法满足定量需求。11种生物碱相似的结构为色谱分离带来了极大的挑战。

基于上述特点,研究员采用UHPSFC -PDA -MS系统,采用筛选加优化的工作流程进行完整的方法开发。在筛选阶段,对流动相B及流动相B中的添加剂进行考察;同时使用PDA和ESI - MS检测器的方法开发思路,获得了不同BAs浓度的宽线性范围,确保其在大多数条件下都可以进行定量。

与此同时,通过利用ACD/ AutoChrom辅助色谱条件优化。在UHPSFC系统中,以DoE原则结合色谱模拟技术,通过对色谱参数中的连续变量(梯度、流速、柱温)进行模型分析,并确定最终色谱条件,确保各组分色谱峰实现基线分离,减少质谱中的基质效应,提高结果的准确性。这也是UHPSFC首次应用于发酵生产的抗生素中BAs的研究,基本涵盖了所有类型的BAs,可以为该类抗生素中BAs的测定提供参考。方法开发过程见图2。

图2 实验流程示意图

方法开发-UHPSFC 色谱参数筛选

根据表1条件,对流动相B及流动相B中的添加剂进行筛选。

表1 方法筛选色谱条件及判定依据

研究员考察了不同流动相B(乙腈,异丙醇和甲醇)对生物碱在MS检测器中的响应情况。通过图3中的11种生物碱的MS提取信号强度,其中甲醇作为流动相B时,各生物碱均有响应,故选择甲醇作为流动相B。但其中亚精胺,精胺和胍丁胺的响应灵敏度低。

因此在第二阶段筛选实验中,为了提高检测的灵敏度,采用11种生物碱的混标溶液,分别考察了在甲醇种加入甲酸,20mM醋酸铵、氨水对MS响应的影响。通过图3中的11种生物碱的MS提取信号强度图,可以发现除了酪胺,其它在加入添加剂后明显增强。其中以加入20mM醋酸铵时,增强最为明显。综合各组分色谱峰的保留因子、拖尾因子,最终选择20mM醋酸铵的甲醇体系作为流动相B。

图3 不同流动相B及添加剂对生物胺在MS检测器中的响应影响

方法开发-UHPSFC 色谱参数优化

用样品溶液在上述筛选实验最终确定的色谱条件下运行时,庚二胺(I.S.)、尸胺(CAD)和腐胺(PUT)三者的分离度不佳(图2a),并且基质干扰严重。相比于RPLC,UHPSFC分离模式下多模式保留机制(如分配、氢键吸附、静电和离子相互作用),很难确定影响影响分离度的关键因素(可能存在多种交互作用)。为了简化色谱条件的优化过程并探索不同色谱条件的相互作用对于分离的影响,以DoE的原则,以庚二胺(I.S.)、尸胺(CAD)和腐胺(PUT)三者的分离度为目标函数,采用ACD/ LC-Simulator软件建构多因素响应曲面,辅助色谱参数优化。

图4 色谱参数优化前(a)后(b)加标样品对比图

为此,在三种不同的流速(1.8、2.0和2.2 mL/min)、三种不同的梯度(1 - 25%(B), 梯度时长20、30和40 min)和三种不同的温度(30、40和50℃)下进行了三因素实验(如表2所示)。

表2 梯度,温度和流速3因素3水平正交实验设计

在此基础上得到27组数据。将这些数据导入ACD/ Spectrus Processor中进行谱图处理,最终利用LC-Simulator得到了基于柱温,流速和梯度的3D分离度图,如图5所示。

图5中的a(1-3)分别代表的3因素构成的3维空间内的响应曲面图,3维空间内的3个切面则分别由3因素两两组合而成。其中b(1-3)代表柱温和流速构建的响应曲面;c(1-3)代表梯度和流速构建的响应曲面;d(1-3)代表梯度和柱温构建的响应曲面。其中橙色区域代表分离度高的参数组合,最差分离度的物质对的分离度,在最优的条件下可达2.45;而蓝色区域则代表分离度差的参数组合,分离度最低为0,即有组分共洗脱。

分别在图a(1-3)中选取了α,β和γ3个条件组合点,其对应在不同视图的2D分离图上也已标识出来。α落在橙色区域内,β和γ均落在蓝色区域内。分别在UHPSFC下运行α,β和γ3个点对应的色谱参数,其对应的谱图分别为e1,e2和e3,关键色谱峰对,均为I.S.,CAD和PUT,e3谱图中3组份完全共洗脱。实验结果和软件预测结果相吻合。从庚二胺(I.S.)、尸胺(CAD)和腐胺(PUT)三个组分的结构考虑,仅仅有一个亚甲基的差异。

图5 梯度,流速和柱温的3D分离度图

研究员在完成了模型分析确认了色谱条件之后,还进行了背压研究,确认了合适的压力条件。通过完整的方法筛选及优化,最终确定的色谱条件见表3。最终的色谱图见图4中的b图,11种生物碱实现基线分离,且排除了基质的干扰。

表3 色谱参数

总结

研究员在此类分析方法开发的过程中,很好地利用色谱模拟技术,针对超临界色谱色谱条件中的连续变量进行DoE并进行模型分析,更快地找到最优条件并确认了最优空间。

日常色谱工作中,连续变化的变量都可以进行色谱的模拟。对于分离难度大,分离要求高的工作,建立数学模型的方法能够更有效的解决问题。

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