解构创新药靶点开发——细胞表面膜蛋白质组学技术

2023-07-31 11:59:22, Untangled

背景介绍

BACKGROUND

细胞表面蛋白质是一类特殊的蛋白质，具有管理细胞功能以及通过转运代谢产物、离子、其他溶质等在细胞与环境之间进行通信等十分重要的功能。细胞表面蛋白质在不同细胞类型之间有所不同。此外，即使是特定的细胞类型，它也可以在正常或患病状态下发生改变。因此，有许多关于细胞表面蛋白的重要应用，例如区分细胞表型和疾病状态，用于预后和治疗靶标等的研发。细胞表面呈现出各种疾病的关键生物标志物和潜在药物靶标。目前，开发的生物制药中约70％是针对细胞表面蛋白的，使得表面蛋白的研究尤为重要，也是各种癌症新疗法的潜在途径。

氨探生物建立并优化了细胞表面蛋白质组学的工作流程。该流程使用初级胺反应试剂（例如磺基- NHS-SS-生物素）对细胞表面蛋白进行生物素标记，使用链亲和素磁珠富集细胞表面蛋白，使用胰蛋白酶消化富集的表面蛋白。采用基于数据独立采集（DIA）的数据采集技术对肽段进行深度细胞表面蛋白质组分析。

图1：细胞表面蛋白质组学的工作流程

氨探生物全面优化了该细胞表面蛋白质组学流程，以获得深度、可重复的结果：

1. 生物素试剂用量

我们比较1mg KG1a细胞用不同浓度的生物素（0.2mM、1mM、5mM）标记和等量的链霉亲和素珠富集，发现0.2mM和1mM生物素试剂鉴定出的蛋白和肽数相当，优于5mM生物素试剂（图2）。在0.2 mM或1 mM时，1mg KG1a细胞鉴定的表面膜蛋白数量在1000个以上，鉴定的多肽数量在10,000个左右。这表明0.2 mM足以标记所有的细胞表面蛋白，5 mM的生物素试剂是多余的，导致较少的肽和蛋白鉴定。因此，使用1 mM的生物素试剂进行后续实验。

图2 1mg KG1a输入时生物素测定剂量（0.2 mM, 1mM和5mM）的优化。（A）使用不同量的生物素试剂鉴定的细胞膜蛋白多肽的数量。（B）使用不同量的生物素试剂鉴定的细胞膜蛋白数量。

2. 蛋白质起始量

我们比较了不同KG1a蛋白输入量（0.5mg, 1mg）的鉴定的细胞表面肽和蛋白。每组进行2个重复，生物素试剂保持在1 mM，0.5mg和1mg KG1a细胞鉴定的表面膜蛋白数量无明显差异，共鉴定出10,000个多肽和1100个细胞表面蛋白。这表明只需要0.5mg的初始量的蛋白质即可富集表面蛋白，显示该流程具有很好的灵敏度。（图3）。

图3 用1 mM生物素标记试剂优化KG1a细胞表面的蛋白输入量（0.5mg, 1mg）。（A-B）鉴定的表面蛋白和肽。

3. 重现性评价

我们在1mg KG1a细胞中使用1mM的生物素试剂进行了三次标记以评估工作流程的可重复性。如图4A-B所示，三次重复鉴定出的表面膜蛋白数量分别为1026、1024、1066种，多肽数量分别为9357、9249、9986种。共有946种蛋白质和7904种肽段在三次重复均被鉴定（图4D-E）。蛋白强度的中位RSD为12%，表明实验过程具有良好的重现性（图4C）。

图4 KG1a表面蛋白组在三次实验中的可重复性。（A-B）鉴定表面蛋白和肽段，（C）定量蛋白强度的RSD箱线图，（E-F）蛋白和肽段重叠。

总结

氨探生物优化的细胞表面蛋白质组学的工作流程，允许简单和快速富集表面膜蛋白。该工作流程具有良好的灵敏度和可重复性。蛋白起始量低至500 ug，即可鉴定~1000种表面膜蛋白，动态范围达7个数量级。

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参考文献

1. Rapid Enzyme-Mediated Biotinylation for Cell Surface Proteome Profiling. Anal Chem. 2021 Mar 16;93(10):4542-4551.

2. The Cancer Surfaceome Atlas integrates genomic, functional and drug response data to identify actionable targets. Nat Cancer. 2021 Dec;2(12):1406-1422.

3. Mass spectrometry and the cellular surfaceome. Mass Spectrom Rev. 2022 Sep;41(5):804-841.

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