项目文章 | 靶向Nrp-1可消除抗PD-1上调的调节性T细胞，并与4-1BB激动剂协同治疗肝癌

免疫检查点阻断（ICB）治疗目前已经是治疗多种肿瘤的主流方法。但是针对肝癌（HCC）的PD-1单抗单独治疗的随机多中心临床试验并未取得良好效果，并且机制尚不明朗。

调节性T细胞（Treg）对PD-1阻断的ICB治疗具有阻碍作用，瘤内的Treg细胞与CD8+T细胞比例亦是一种重要的预后指标。肝脏做为一种免疫耐受器官，具有天然强大的抑制性免疫微环境，Treg等免疫抑制细胞大量浸润。介于瘤内Treg细胞主要来自于外周淋巴组织迁移而来，研究Treg迁移的轨迹以及Treg在适应迁移后发生的转录组特征改变，对Treg细胞趋化机制，以及针对Treg细胞迁移进行特异性靶向治疗具有重要意义。

Result1 PD-1治疗后并未缓解肿瘤内免疫抑制，且Treg细胞出现累积。

为了探索PD-1阻断治疗后肿瘤微环境的变化，作者对单独进行PD-1治疗的肝癌模型小鼠以及对照组小鼠均取肿瘤组织进行了CD4+/CD8+T细胞的分选，之后进行10X Genomics单细胞测序，最终对9334个细胞进行分析。

作者首先研究CD8+T细胞在PD-1阻断治疗后的基因表达变化，发现部分毒性相关基因没有在治疗后上调表达，认为PD-1阻断未能激活毒性T细胞发挥杀伤作用。

进一步对CD8+T细胞进行拟时序分析，发现PD-1阻断治疗并没有改变CD8+T细胞的分化轨迹，在治疗后仍有大量耗竭T细胞以及增殖状态的耗竭T细胞。PD-1治疗并未能扭转肿瘤内的免疫抑制状态。

接下来，作者对CD4+Treg与CD8+T细胞的比例进行分析，发现PD-1治疗后Treg细胞出现累计效应。结合临床数据以及实验验证，发现肝癌的PD-1治疗后，Treg细胞与CD8+T细胞比例呈增长态势，并且发现Treg细胞在肿瘤内部以及周围组织均有累积。

图1

Result2 PD-1阻断后，外周淋巴组织Treg细胞增殖并迁移至肿瘤微环境。

作者进一步对Treg累积的细胞来源进行研究，通过实验排除了Treg细胞在肝癌微环境中原位增殖和TGF-β诱导的可能。通过构建连体共生小鼠模型，发现在抗PD-1诱导累积的Treg是由外周淋巴组织完成增殖并向肿瘤区域迁移 。

图2

Result3单细胞测序揭示Treg的组织适应性变化以及迁移前后的关键基因Nrp-1的变化。

为了研究Treg细胞在迁移前后发生的基因表达变化，作者对外周组织、肿瘤组织以及周围组织的CD4+/EGFP细胞进行了富集与单细胞测序，通过降维聚类获得8个细胞群，其中有6个群为Treg相关细胞。基因表达分析发现，C2具有较显著的迁移相关基因特征表达。C3具有和肿瘤免疫抑制相关的特征基因表达，推测为肿瘤区域Treg细胞（Ts-Treg）。

为了进一步了解Treg细胞的迁移轨迹与组织适应性，作者对Treg细胞进行了拟时序分析，结果发现外周淋巴来源的Treg细胞在拟时序轨迹上逐步向Ts-Treg细胞进行转化，证明了Treg细胞由外周淋巴组织迁移至肿瘤区域的推断。进一步对高变基因进行动力学分析，发现免疫抑制相关基因(如Tnfrsf9)呈现不断增强的趋势，而部分迁移相关基因（如Nrp-1）在时序轨迹上呈现出先升高后降低的趋势。之后作者为了探究Treg细胞中的转录因子以及下游靶基因的共表达情况，对Treg细胞进行了SCENIC分析，结果发现免疫抑制相关转录因子Crem以及其下游靶基因Tnfrsf9在Ts-Treg细胞中具有特异性共表达趋势，进一步说明了Ts-Treg 发挥了较强的免疫抑制功能。

为了验证Treg细胞在迁移过程中，迁移基因Nrp-1以及免疫抑制基因Tnfrsf9(4-1BB)的变化情况，作者针对临床样本以及体内模型进行了验证，发现其细胞数目的变化趋势与基因表达变化趋势基本一致，Treg细胞在向肿瘤区域迁移的过程中逐渐由Nrp-1+/4-1BB-细胞转变为Nrp-1-/4-1BB+细胞。

以上结果说明Nrp-1以及4-1BB可以作为HCC的潜在治疗靶点。

图3

Result4 转录组测序揭示Nrp-1敲除后Treg细胞迁移能力减弱。

为了进一步验证Nrp-1对Treg细胞迁移的协助作用，作者通过构建FOXP3/Nrp-1-的基因敲除鼠，分选了其脾脏以及淋巴结中的Treg细胞进行RNA-seq（N=4），差异基因以及功能富集显示，Nrp-1敲除后，细胞黏附以及趋化相关通路均出现下调，说明Treg的迁移能力受到影响。

图4

Result5 Nrp-1抑制与4-1BB激动协同治疗HCC

作者发现Nrp-1敲除虽然减轻了抗PD-1治疗有道德Treg细胞的迁移和肝癌中的积累，并延缓肿瘤发展，但是无法与抗PD-1治疗协同，唤醒抗PD-1的肿瘤杀伤作用。因此作者结合现有的研究结果，发现4-1BB的激动剂（3H3）治疗对于增强CD8+T的浸润激活，减少肿瘤Treg都具有促进作用。之后，作者通过多种小鼠肝癌模型验证了同时靶向4-1BB和Nrp-1能逆转肝癌免疫抑制微环境。在人源化HCC模型中二代4-1BB激动抗体LVGN6051与Nrp-1抑制剂EG01377协同治疗肝癌具有比单药治疗更好的抑癌效果。该双重靶向方案能逆转肝癌对帕博丽珠单抗治疗的抵抗。(这一部分图片缺如，图5)

图5

END

排版人：七七

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