STTT | 重磅综述-癌症代谢研究利器

肿瘤细胞在重编程代谢方面具有极高的灵活性，以推动肿瘤的发生、进展、转移和对治疗的抵抗。这些重编程的活动包括对细胞生物能、生物合成和氧化还原状态的全面重构，以满足细胞的能量需求增加。代谢组学和代谢流组学（fluxomics）是主要革命性技术方法，使研究人员能够对癌症中的生化活动进行定性检测和机制分析。此外，从大规模分析转向单细胞分析技术提供了前所未有的机会：对癌症生物学指标进行深入的定量分析，实现对复杂和异质性疾病的研究。

1910年，Joseph J. Thomson首次测量了分子的质谱图。1931年，Otto H. Warburg因为对呼吸酶的表征而获得了诺贝尔医学奖。1938年，Isidor I. Rabi首次在氯化锂束流中检测到核磁共振（NMR），从而发展了该方法，并在1946年由Felix Bloch和Edward M. Purcell扩展到液体和固体。气相色谱-质谱（GC-MS）于1959年出现，液相色谱-质谱（LC-MS）于1974年引入。癌基因和肿瘤抑制基因的发现可以追溯到20世纪80年代。1994年，Tsutomu Nomizu和他的同事首次实现了单细胞质谱实验检测，而在1998年，Steven Oliver首次引入了代谢组学的概念。2004年出现了下一代测序（NGS）技术，2007年诞生了飞行时间细胞流式细胞仪（CyTOF）的首个原型和人类代谢组数据库（HMDB）的第一个版本。2009年发展出了单细胞RNA测序（scRNAseq），2016年发展出了单细胞代谢组学（SCM），2017年发展出了空间代谢组学。2014年进行了首次全基因组功能筛选，2020年Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因发现CRISPR/Cas9系统而获得诺贝尔化学奖。2020年，基于流式细胞术的Met-flow和SCENITH技术被提出。2022年，Douglas Hanahan最终将细胞代谢的失调认定为癌症的核心特征。

图1. 癌症代谢研究的重要事件时间线

代谢组学是对小分子代谢物的高通量研究，包括细胞、生物体液、组织等基质中具有不同生理化学特征和动态丰度范围的所有小分子(50‑1500Da)，通常称为代谢物。鉴定与其他组学检测不同，代谢物及其浓度直接代表分子表型。代谢组学用于癌症研究，以有效检测生物样品中其水平受肿瘤进展影响的代谢物，具有广泛的应用，如生物标志物筛选鉴定、药物发现或开发、临床毒理学、营养研究和定量表型分析。

代谢组学有两种检测策略：靶向或非靶向分析。靶向（或基于验证）代谢组学方法的目标是识别和量化相对较少（＜100）的已知分析物，而非靶向（或基于发现）代谢组学用于更全⾯的分析和代谢物的相对定性和定量。靶向方法具有准确定性定量测定目标物质的优点，但它的局限性在于部分代谢组学覆盖，有可能遗漏其他类别的代谢物导致目标代谢通路的不完整。非靶向代谢组学方法的分析虽然不需要任何预先存在的知识或假设，覆盖的代谢物种类更全面，但因其鉴定参照往往来自于商业库，或受到生物样本基质效应的影响，导致其定性和定量的准确性不能得到有效保证。

代谢组学样品制备包括代谢淬灭和代谢物提取。代谢物需要通过气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、毛细管电泳（CE）进行分离，或者可以直接在直接进样（DI）和质谱成像（MSI）中进行离子化。可以使用不同的离子化技术：电子碰撞离子化（EI）、化学离子化（CI）、大气压化学离子化（APCI）、电喷雾离子化（ESI）、基质辅助激光解吸离子化（MALDI）。可以选择单一（MS）或串联（MS/MS）质量分析仪器来根据离子的m/z值进行分离：四极杆（Q）、四极离子阱（QIT）、飞行时间分析仪（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）、轨道阱（OT）。数据处理包括m/z值的转换、基线过滤、归一化和鉴定等。

图2. 基于质谱（MS）的代谢组学工作流程

代谢组学是一种可靠的技术，能够识别与肿瘤相关的代谢特征；但往往无法揭示代谢通路的可塑性和动态性，仅提供了癌细胞代谢的静态快照。代谢流分析（MFA）利用稳定同位素标记的底物可以通过追踪下游代谢产物中特定原子的同位素富集情况来确定通量速率，从而真正连接组学分析和表型（图3）。如图3所示，第一步是设计实验，包括通过计算模拟确定最佳示踪剂以获得最高通量分辨率和底物标记。在稳定同位素示踪剂的给予后，样品会被分析其同位素标记和外部速率，外部速率考虑了底物的吸收和产物的分泌。代谢物的标记可以通过质谱（MS）或核磁共振（NMR）来测量，并整合到代谢网络模型中，标记测量要适应模型，并包括所有相关反应及其相应的碳原子转换。

图3. 代谢流分析（MFA）的实验工作流程

细胞外通量分析（EFA）是利用Agilent Seahorse XF分析仪作为领先技术的一种方法。它是广泛定量活细胞、器官样或组织的生物能活性的最常用和可行的方法（图4）。简而言之，EFA通过定量测量线粒体电子传递速率（被称为线粒体氧化磷酸化作用）的氧消耗速率（OCR），以及通过乳酸生成的细胞外酸化速率（ECAR）来衡量糖酵解的结果。该仪器通过从微孔板中的细胞单层中取少量培养基（仅几微升）实时测量OCR和ECAR。两个安装在光纤探针中的传感器用于在几分钟内定量测量氧气水平和培养基pH值，然后软件外推OCR（pmol/min）和ECAR（mpH/min）的定量结果。

关键的代谢途径控制着癌细胞的生长，可以通过EFA进行检测。（图4）通过连续注射葡萄糖、奥利司他霉素和2-脱氧葡萄糖（2-DG）进行糖酵解应激试验，以获取糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备和非糖酵解酸化测量的结果。ECAR代表细胞外酸化速率。糖酵解速率试验报告了多个关键参数，如基础糖酵解、通过罗特侬和抗霉素A抑制线粒体呼吸而实现的代偿性糖酵解。质子外流速率（PER）是糖酵解过程中排出细胞外介质的质子的定量测量。细胞线粒体压力试验通过定量测量氧气消耗速率（OCR）来测量线粒体呼吸。细胞依次接触奥利司他霉素、4-(三氟甲氧基)苯基腙氰和罗特侬和抗霉素A，从而测量基础呼吸、最大呼吸和呼吸潜力（spare respiratory capacity）。底物氧化压力试验通过与标准的细胞线粒体压力试验结合使用特定抑制剂来测量长链脂肪酸（LCFAs）、葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺作为主要底物对线粒体代谢的贡献。

图4. 通过细胞外通量分析 (EFA)检测的控制癌细胞生长的关键代谢途径

截至目前，关于癌症代谢的大多数研究结果是通过细胞培养模型和从体内获取的肿瘤样本中检测获得的。代谢组学和EFA分析的一个最大限制是它们不能同时进行代谢状态和表型分析。每个细胞的结果都受到遗传和环境因素的影响，因此与细胞种群的异质性很难兼容。此外，标准细胞培养基与人体生理营养环境并不相似，肿瘤微环境中的营养物可用性明显调节代谢依赖性。单细胞测序scRNAseq的出现为以高分辨率检测肿瘤的基因组特征提供了前所未有的机会。检测代谢基因表达变化是扩展对癌症代谢重组的理解和识别代谢特征的有力工具。通过微流控装置将收集在亚微升级液滴中的单个细胞分选到多孔板上；在细胞溶解后，通过条形码对细胞进行编码，以将测序数据分配给每个细胞（图5）。这一技术进步得益于能够捕获和测序极少量的RNA。scRNAseq研究显示，恶性细胞普遍上调几乎所有功能类别的代谢途径相关基因，表明其具有高度的代谢可塑性，使其能够适应不同的遗传和环境因素。代谢基因的整体转录重组表明，癌细胞为这些基因的表达保留了更多的转录资源，从而增加了大多数代谢反应的通量。

单细胞代谢组学(SCM)提供了生物系统中细胞代谢的所有代谢物、中间体和最终产物的快照，解码细胞内的生化异质性。制备单细胞样品的最大挑战是避免或至少减少样品处理对细胞代谢的影响。单细胞样品制备的标准方法是荧光活化细胞分选(FACS)和微流体阵列，保持完整的细胞形态或通过原子力显微镜(AFM)探针提取，探针中只保留细胞的代谢物。细胞代谢应被淬灭，并可通过基于质谱的技术进行分析(图5b)。先前针对单细胞水平代谢基因的基因组分析表明，个体恶性细胞具有在大量肿瘤研究中未观察到的代谢活性升高和变异。相对于scRNAseq，SCM有助于解剖细胞异质性，因而在肿瘤疾病和转移检测、精确药物设计、药物评估和毒性方面尤其有用。此外，SCM还可用于分析罕见或循环肿瘤细胞(ctc)以及癌症亚型区分和新疗法开发。

目前已经有几种基于细胞计数的方法将代谢分析与单细胞表型相结合。荧光代谢探针和代谢物类似物可以通过流式细胞术或显微镜进行分析，从而实现单细胞分辨率，它们通常用于代谢预筛选分析，因为它们快速，相对便宜，并且易于适应不同的实验设置。例如:2- nbdg是一种监测活细胞中葡萄糖摄取的荧光指示剂;BODIPY用作多种荧光磷脂的合成前体;CM-H2DCFDA是细胞中ROS的有用指示物;半胱氨酸-异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物监测氨基酸的吸收和积累;单胺尸体碱(MDC)追踪自噬液泡。

一种基于流式细胞术的创新方法可以用单细胞分辨率分析能量代谢(图5c)。单细胞能量代谢分析翻译抑制(SCENITH)基于代谢依赖的翻译率和嘌呤霉素并入新生蛋白来测量代谢谱。用靶向抑制剂孵育给定样品，可以从功能上估计葡萄糖和线粒体依赖性、糖酵解、脂肪酸和氨基酸氧化能力。嘌呤霉素化检测可以与多参数流式细胞术分析相结合，从而分析单细胞复合物和异质样品。到目前为止，SCENITH已应用于分析离体全血和人类肿瘤活检。有趣的是， 对肾癌和肿瘤旁组织进行SCENITH与scRNAseq联合分析，成功地将代谢谱和代谢基因表达联系起来。此外，SCENITH可用于许多其他肿瘤设置和生理病理条件，包括理解与代谢和氧化还原失衡具有重要和多重联系的细胞死亡途径。

2007年，Scott D. Tanner受到流式细胞术技术的启发，发明了质量细胞术，也被称为飞行时间细胞术(CyTOF)，这是高维和高通量蛋白质(和代谢)单细胞分析最有前途的技术(图1)。CyTOF使用非生物可利用的金属同位素，具有简明的质谱参数，以取代标准的荧光标记。通常用于流式细胞术。可同时研究多达50个参数，克服了与重叠发射光谱相关的所有缺陷，这些缺陷通常用于基于荧光的分析(图5d)。此外，还有一种利用代谢成像来定量组织切片内单细胞酶活性的新方法——通过原位脱氢酶活性测定，定量测定在主要代谢途径中催化关键步骤的五种酶的活性[PPP中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)，糖酵解中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，乳酸发酵中的乳酸脱氢酶(LDH)，以及TCA循环中的IDH和SDH]，以区分和表征细胞群体 (图5e)。

图5. 肿瘤微环境（TME）研究的先进技术的全局概述

在过去的二十年里，已经提出了用于基于MS和NMR 的代谢组学的更先进的数据处理技术，包括用于峰检测和对齐的软件（例如 XCMS、MZmine2、Open‑MS、MS‑DIAL、eRah、ADAP‑GC , BinBase)，它可以从大而复杂的数据中进行光谱注释和识别。统计分析，包括单变量和多变量分析，用于识别显著表达的代谢物，然后将其与生物学相关联，通过使⽤专门工具（例如KEGG）执行的功能分析过程，将代谢物映射到已知的生化途径。最后，代谢组学数据可以与其他组学数据（转录组学、蛋白质组学或微生物组）整合，以充分描绘⽣物系统的复杂性。

事实上，结合多组学数据的问题更多地与设计适当的策略有关，而不是开发新的分析工具。事实上，关联分析和分类器的开发已经成功地应用于代谢组学数据，就像以前在基因组、转录组学或蛋白质组学数据上用于区分肿瘤亚型一样。与全基因组关联研究类似，对生物体液或组织进行了代谢组学分析，目的是确定对不同疾病的易感性标记，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。然而，这些研究仅限于样本生物学的单一维度，需要在独立的队列中进行验证，并且只能找到模式与特定生理病理状态之间的关联，这并不能证明因果关系，应从关联研究转向确定癌症中不同水平的基因表达和代谢调节及其失调之间的因果关系和复杂相互关系。

本综述讨论的最新技术和概念进展，从代谢组学到单细胞方法，使代谢成为癌症生物学研究中最有活力和最富有成果的领域之一。代谢组学是推动这一变革的主要技术，已经展示出在肿瘤学临床应用中对癌症研究未来产生巨大潜力的能力。这些分析仍需要更深入地了解定性和定量结果如何反映人体生理的真实情况，以及生物体液中的代谢物组合在多大程度上反映了肿瘤的代谢环境。

过去40年来，新技术的发展、更易获取的、更强大和更高分辨率的能力推动了癌症研究前所未有的进展。特别是高通量的单细胞技术的出现为以细胞为分辨率研究癌症生物学提供了前所未有的工具。这些代谢工具应以互补的方式使用，将描述性研究与功能性研究相结合，为癌症的研究、诊断和治疗开辟创新途径。通过结合这些技术，能够扩展对肿瘤的理解，并为新的抗癌策略铺平道路。

参考文献

To metabolomics and beyond: a technological portfolio to investigate cancer metabolism. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2023.

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