REDOX BIOL（IF：10.787） | ​靶向代谢与空间代谢组联用探究抑制琥珀酸氧化减轻脑损伤的机制

中风是全世界死亡和残疾的主要原因，其中缺血性中风是最普遍的亚型。目前对于缺血性中风的治疗手段有静脉注射蛋白酶以及机械血栓切除术。尽管后者具有立即恢复血液流动的优势，但是缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）损伤会导致病变，因此会损害健康。这种IR损伤被认为与缺血再灌注时出现的超氧化物有关，造成急性组织损伤并导致进一步的组织炎症和胶质增生。作者近期的研究表明，缺血期间线粒体代谢物琥珀酸在组织内急剧积累，然后在再灌注时被琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）迅速氧化，通过反向电子运输（reverse electron transport，RET）驱动线粒体复合体I产生超氧化物，从而启动IR损伤。而用其竞争性抑制剂丙二酸的细胞渗透性原药酯阻断SDH的琥珀酸氧化，可以改善心肌梗死。丙二酸二钠（disodium malonate，DSM）形式给药的丙二酸本身被单羧酸盐载体（mono carboxylate carriers，MCT）选择性地吸收到缺血组织中。因此，DSM对减少心脏IR损伤非常有效。这意味着在机械血栓切除术的同时给予丙二酸盐，可能有作为辅助治疗的潜力。因此，本文使用了靶向和高分辨率的非靶向代谢组学来比较人和小鼠大脑对缺血的代谢反应。同时，作者使用质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）来观察小鼠中风模型在缺血期间和再灌注后琥珀酸水平的变化。最后，作者评估了在缺血后再灌注时将丙二酸作为DSM使用是否对急性脑损伤有保护作用。综上，本文研究结果支持在机械血栓切除术中输注丙二酸作为治疗缺血性中风的辅助疗法的潜力。

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前言

2023年1月，剑桥大学（University of Cambridge）的Murphy''s & Krieg实验室（Murphy''s & Krieg''s lab）在Redox Biology期刊（IF 10.787）发表题为“Targeting succinate metabolism to decrease brain injury upon mechanical thrombectomy treatment of ischemic stroke“的研究成果。通过非靶向代谢组、靶向代谢组及空间代谢组，发现了血栓切除后，缺血再灌注期间，抑制琥珀酸氧化可以减轻脑损伤,为治疗缺血性中风提供理论依据。

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研究思路

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研究方法

研究材料：（1） 8例人脑：来自接受神经外科手术切除不同类型脑瘤的病人；（2） 小鼠脑；

研究技术：

（1） LC-MS非靶向代谢组

（2） LC-MS/MS靶向代谢组

（3） DESI-MSI空间代谢组

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研究结果

作者首先用非靶代谢组分析了小鼠和人类大脑在常氧状态下的代谢组。发现缺血时，小鼠和人类的琥珀酸盐在缺血时都显示出快速的增加（图1A）。二者的ATP和ADP水平快速下降，而乳酸水平有所增加（图1C）。韦恩图则表示小鼠和人类之间代谢物随时间变化的广泛相似性，显示人脑在热缺血（warm ischemia）期间改变的大多数代谢物，在小鼠大脑热缺血期间也发生了变化（图1D）。主成分分析显示，人和小鼠大脑在热缺血期间都有明显的代谢物变化模式，而这在小鼠中更为明显，缺血时间占代谢物变化的83.9%（图1E）。

图1 人和小鼠大脑在常氧状态下的随时间变化代谢

组差异，以及对体外热缺血的反应

火山图显示，显示人脑和小鼠脑之间有相当大的相似性（图2A和B），缺血60分钟后，人脑中琥珀酸水平增加了2倍，小鼠脑中增加了3.5倍。除此之外，小鼠和人脑在缺血后发生的其他一些明显的变化是嘌呤降解的产物（如次黄嘌呤（hypoxanthine）和黄嘌呤（xanthine））丰度增加。几个酰基肉碱（acylcarnitines ）的水平随着时间的推移而减少，焦谷氨酸（pyroglutamate ）是两个物种中最明显的累积代谢物。不饱和长链脂肪酸（如c20:4、c22:4、c22:5）也有类似的变化，这可能表明磷脂的脂肪分解增加。腺苷（Adenosine ）在小鼠脑缺血期间增加，但在人脑中减少。此外，由腺苷脱氨形成的肌苷（inosine）在缺血的人脑中保持稳定，而在小鼠脑缺血期间其水平增加。有五种代谢物（N-乙酰普鲁卡因（N-acetylputrescine）、ophthalmate、棉子糖（raffinose）、二氢生物蝶呤（dihydrobiopterin）、肌氨酸（sarcosine）在人脑中被检测到，但在小鼠脑中却低于检测限，尽管这些代谢物的水平在缺血时没有变化。因此，人和小鼠大脑在长期缺血期间的代谢变化大致相似，特别是观察到琥珀酸的积累，证实了其作为治疗目标的潜力。

图2 火山图显示60分钟体外热缺血后的

代谢物水平与正常缺氧相比的变化

上述结果表明，在人和小鼠的体外脑组织中，全局性的热缺血期间琥珀酸盐会积累。然而，在缺血性中风期间，只有大脑的局部区域受到影响。因此，评估缺血性中风期间琥珀酸盐在大脑内的分布是了解其在病理中潜在作用的关键。接下来，作者使用了短暂性大脑中动脉闭塞（transient Middle Cerebral Artery Occlusion，tMCAO）的小鼠模型（图3A），将管内丝线插入中部颈动脉（middle carotid artery ，MCA），在原位停留45分钟，然后取出，以模拟机械血栓切除。这种方法实现了快速再灌注，很好地复制了患者通过机械血栓切除恢复血流后缺血组织的快速再灌注。

为了评估琥珀酸盐代谢对梗塞形成和演变的潜在贡献，作者用LC-MS/MS测量了小鼠大脑同侧和对侧半球缺血期间琥珀酸盐的积累，并与未暴露于缺血的假手术小鼠进行比较（图3B）。在缺血期间，琥珀酸盐在同侧半球积累了4-5倍，而在对侧半球则没有。再灌注5分钟后，同侧脑半球的琥珀酸盐水平已恢复到常氧组织的水平。

图3 小鼠脑卒中模型中的代谢物分布：tMCAO后再灌注

尽管根据上述研究结果以及经验，确定了危险区域，但可能包括健康和梗塞的大脑区域。为了更好地确定一系列代谢物在两个大脑半球的分布和相对定量，作者将解吸电喷雾电离成像质谱法（DESI-MSI）应用于大脑切片。通过空间代谢组结果，作者进一步确定了小鼠大脑中受tMCAO影响的非缺血和缺氧区域（图3C）。通过提取不同区域的代谢物信息，作者发现，琥珀酸盐在同侧脑半球的缺血病变部位出现积累（图3D）。重要的是，缺血期间积累在该区域的琥珀酸盐在再灌注时迅速消失（图3D）。与琥珀酸相反，其他TCA循环代谢物在缺血期间被耗尽（图3E），这与缺血期间琥珀酸的选择性积累相一致。乳酸也出现了积累，但它的水平在再灌注后仍然升高（图3F）。诱导缺血后，缺血病灶的ATP和ADP急剧下降，再灌注5分钟后再次测量时没有再生（图3G和H），这表明再灌注后受影响的大脑区域的细胞功能和能量代谢没有完全重建。嘌呤核苷酸分解和糖酵解途径中的其他关键代谢物的丰度变化反映了小鼠大脑体外缺血的情况。这些发现在缺血期间琥珀酸积累，然后在再灌注时迅速消失，这与机械血栓切除术治疗缺血性中风期间琥珀酸在SDH的氧化是一致的。

上述发现表明，琥珀酸盐在缺血期间在大脑中大量积累，然后在再灌注时迅速氧化。这些结果与再灌注时琥珀酸盐氧化驱动线粒体超氧化物的产生，导致机械血栓切除后的脑损伤是一致的，并表明再灌注时抑制琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）可能提供对IR损伤的保护。因此，作者接下来静脉注射丙二酸二钠（disodium malonate，DSM），持续20分钟，从清除管内丝线前10分钟开始，随着缺血脑组织的再灌注而持续（图3A）。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色和组织学测量，输注DSM明显减少了急性脑损伤（图4A和B），并导致脑组织（图4C）和脑脊液（cerebral spinal fluid，CSF）（图4D）对丙二酸的显著摄取。这些发现表明，丙二酸对急性IR损伤的保护是在其被吸收到脑组织之后，表明丙二酸在这些条件下可以通过血-脑和血-CSF屏障，并与它通过抑制SDH的保护作用相一致。

 图4 丙二酸盐在小鼠脑卒中模型中的影响

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研究结论

综上所述，这项研究揭示了人和小鼠大脑对温暖缺血的代谢反应的相似性，并表明不同物种琥珀酸盐代谢的变化在缺血期间是保守的。这表明在再灌注时抑制琥珀酸盐的氧化是一种潜在的可转化的干预措施，与机械血栓切除术结合起来治疗缺血性中风。

文章推荐

本研究使用人脑组织和小鼠脑组织，通过非靶代谢组发现了如琥珀酸等物质的显著变化，并用靶向代谢组对这些物质的变化进行了定量研究。为探究脑卒中缺血期间和再灌注后的琥珀酸盐分布情况，作者使用空间代谢组这一技术手段，清晰地观察到了琥珀酸等物质在缺血期间的积累以及再灌注后的消失。最后通过给药处理，进一步发现脑卒中缺血再灌注引发脑损伤的机制以及丙二酸盐可以减轻这一损伤。本篇文献是典型的表型-机制-回补文章。

参考文献:1. 10.1016/j.redox.2023.102600